안녕하세요.    Extracted mRNA로부터 만들어진 cDNA를 증폭할 때, 왜 primer를 forward와 reverse.. 이렇게 두 개를 쓰나요?   mRNA는 genomic DNA strand 중 single strand로부터 유래하기 때문에, 당연히 mRNA도 single strand로 존재하고, 그에 따라 당연히 해당 mRNA로부터 유래한 cDNA 또한 single strand로 존재합니다. 따라서 이 때, primer는 forward만 사용하면 될 것 같은데.. 왜 reverse primer까지 PCR 할 때 추가해야합니까? 어차피 추출한 mRNA에 대한 상보적인 sequence를 가진 strand가 없기 때문에 reverse primer는 넣어줘도 작용하지 않을 것 같은데.. 고수님들 고견 부탁드립니다.

3,4,5,6,7번 primer가 전부 안뜨고 8,대조군만 뜹니다 이게 왜 그런지 잘 모르겠습니다... 참고로 1번은 primer 0ul, 2번은 primer 1ul, 3번은 primer 5ul (여기까지 primer 1pmol/ul 농도로 사용) 4번은 1ul, 5번은 1.5ul, 6번은 2ul, 7번은 4ul, 8번은 5ul, 대조군은 2ul primer 10pmol/ul로 사용했습니다.

primer 주문하고 1 band 뜨는지 PCR로 확인할 때 RNA를 사용하라고 배웠는데 cDNA를 사용해도 상관없나요?

Biological 3 반복 Technical 3반복 ㅎ해서 총 9반복으로 진행했는데 .. ……B1……B2….. B3 T1……21…… 23 …..24 T2 …..21…….23…… 24 T3……21…… 23….. 24 이렇게 biological 간의 ct값 차이가 큰데 괜찮은 건가요.? 각각 샘플이 다른건 맞지만 biological로 같은 실험군에 속하는 건데 ct값 차이가 커도 되는지… ……..B1____B2 ____B3 T1___21____18_____ 19 T2___21___ 18 _____19 T3 ___21 ___18 ____19 프라이머마다 비슷한 ct값이 나오는 것도 있지만 어떤 프라이머에사는 위처럼 ct값이 biological마다 다르게 나올때가 있는데 이런 상황이 괜찮은건지 궁금합니다ㅠㅠ Melting curve는 one peak로 잘 나왔습니다…

  안녕하세요 근래에 qPCR을 진행하고 있는 대학원생입니다.... 다름아니라 제가 현재 pUC19 plasmid를 사용하여 qPCR을 진행중에 있는데 plasmid를 serial dillution하여 qPCR을 진행하였을 때 자꾸 낮은 농도의 sample에서 원치않는 melt peak를 확인하여 이에 관해 조언을 구하고자 질문드립니다....... 저는 이것이 qPCR로 측정하기에 너무 낮은 농도여서 이렇게 뜬다고 판단을 하고 있습니다... 지식이 풍부하신분들께 조언을 구하고 싶습니다....   pUC19에서 target한 부분은 ampr부분이며   qPCR condition은 pre denaturation  95도   2min denaturation        95도    30s annealing            55도   30s extension            72도    5s melt curve작성 으로 진행하였습니다....   qPCR 사진을 첨부드립니다..... cq 값이 높은 것이 높은 농도의 sample(10^11 copy)이며    낮은것이 낮은 농도(10^5 copy)의 sampleㅇ 입니다. melt curve 시뮬레이션을 통해 약 87도에서 peak가 뜬다는 것을 확인하였고, 높은 농도(10^11 copy)를 돌렸을 때는 peak가 잘 떳다고 판단되었으나 10^5 copy의 낮은 농도 sample에서는 peak가 요상하게..... 나왓습니다.......   추가 실험으로 더 낮은 농도도 돌려봤는데 그것도 요상한 peak가 나타났습니다......   읽어주셔서 정말 감사합니다...

타겟 식물에서 UGT 유전자에 대해 primer를 설계해서 타겟 식물의 UGT 유전자 서열이 NCBI에 없어서 시퀀싱하여 다른 종들과 alignment해 보고자 하는데,   primer를 설계할 때 같은 유전자를 갖는 다른 종의 염기서열을 이용해서 primer를 설계하여 PCR을 돌려보는 것은 시도해볼 만한 괜찮은 접근인가요??   찾은 논문에서는 Rhodiola에서 적용할 primer를 애기장대와 같은 다른 식물의 염기서열을 이용하여 primer를 짜서 사용한 거로 이해해서 질문드립니다.   참고논문 : Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for High-level Production of Salidroside from Glucose

안녕하세요  qPCR을 주로 사용하다 현재 PCR을 사용하여  primer 사용 test를 진행하고 있는 대학원생입니다.  실험실에서 주로 gDNA만 사용을 하다 갑자기 plasmid를 함께 사용하게되어 지식이 많이 부족하여 조언을 구하고자 합니다...   먼저 제가 사용하고 있는 plasmid는 pUC19 이며 논문에 기재되어있던 primer인  F- 5'-CCGGCAACAATTAATAGACTGGAT-3' R- 5' -GGGCCGAGCGCAGAA-3' 을 사용하여 PCR을 진행중에 있습니다!   PCR condition은 (HiFi polymerase 사용) pre denaturation 95도 2min denatureatuon  95도 30s annealing  60도  30s extension   72도  5s + 72도 5분   4도씨로 유지 로 진행하였습니다!   이렇게 진행한 결과 자꾸 pcr이 아예 되지 않는 듯한 결과를 보이더라구요... qPCR에서 진행을 해보니 거기서는 또 증폭이 되는 듯하고.... PCR과 qPCR에서 같은 template 같은 condition으로 진행하였을때 증폭 여부가 갈릴수도 있는 것인가요...? melt peak는 one peak 입니다ㅠ! PCR조건도 계속 변경해보고 polymerase 변경(PFu로)해보고 혹시 몰라 dna도 새로 prep하고 재료도 모두 새것으로 사용해보았는데도 계속 이러한 결과를 띕니다ㅠㅜ 조언부탁드립니다ㅠㅜㅠ   사용한 plasmid는 EcoR1으로 onecut하여 사용하였습니다! 제한효소 처리 사진과 PCR사진을 모두 첨부드립니다...done band가 뜬 친구들만 사용하였습니다!   PCR을 진행하였더니 이렇게 자꾸 위에 이상한 band가 뜨고 원하는 band (65bp)가 뜨질 않습니다ㅠ!! (1.100 marker)   조언 부탁드리겠습니다ㅠ 정말 감사합니다ㅠ

식품에 살모넬라 검출 여부를 확인하고자 RT PCR이랑 배지법을 했는데 배지는 양성이고 RTPCR은 음성인데 이게 가능한가요? 오히려 배지는 생균을 보는거고 PCR은 사균,생균을 다보는건데 말이죠

안녕하세요, pcr primer를 처음 짜 보는 학부생입니다. primer 앞뒤에 enzyme site와 cutting에 필요한 여분의 nucleotide를 붙이려고 하는데, primer의 GC content를 계산할 때 이 enzyme site와 여분의 nucleotide까지 포함해서 계산하나요? 아니면 Tm을 계산할 때처럼 template과 annealing하는 부분에서만 GC content를 따지면 되는 건가요...? 

qPCR을 처음해보아서 논문에 명시된 프라이머와 사이클셋팅값을 동일하게 진행하였는데, 결과가 이상하게 나와서 질문올립니다.. 논문에는, PCR amplification conditions on the Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System: 58'C for 5 minutes; 95'C for 2 minutes; 40 cycles of 95'C for 15 seconds and 60'C for 60 seconds. 이라고 적혀있어, 첨부드린 사진과 같이 셋팅하여 돌렸습니다. Hold[step1: 58'c 5min, step2: 95'c 2min] PCR[40 cycle[step1: 95'c 15sec, step2: 60'c 1min]] 다음 Melt curve 셋팅은 논문에 나와있지 않은것 같아 랩실 디폴트값 그대로 돌렸습니다.  논문에 적힌 셋팅값을 제가 제대로 이해못하고 돌린 것인지, ,샘플이 5개이고 보려는 유전자가 5개였는데 각 샘플에 2개 막대픽만 나와서 혼란스럽습니다.. 랩실 디폴트값과 다르게 셋팅한 건 Hold condition부분 뿐인데 그냥 논문 무시하고 디폴트값으로 돌리는게 맞는건지,,,ㅜㅜ 논문에서 말하는 셋팅값의 정확한 의미도 알고싶습니다..자세한 condition이 나와있지않아 이해하기 힘들어요ㅠ pcr고수분들 답변부탁드려요

전에는 잘되던 PCR이 갑자기 smear(끌림) 현상이 발생하게 되었습니다. 9월29일 사진 10월14일 사진                 target size 1687bp PCR조건) 95°C 3분, 95°C 30초, 60°C 30초, 68°C 1분30초, 68°C 5분 Tm) F : 68.x / R : 67.x DNA template 농도 : 모름 PCR product Total volume(20µl) : premix 10µl + F 1µl + R 1µl + template 4µl + SDW 4µl Agarose 1.2%, Ladder 1kb, Etbr 지금까지 바꿔본 조건) DNA 문제 확인 -> universal primer 사용(pcr product 조건 동일) -> 이건 잘됨 Primer 재주문 -> 실패 Template 양 바꾸기 -> 실패 Template 농도 10배, 100배 희석 -> 실패   이렇게 했는데 또 어떤 조건을 바꿔야 하는지 잘 모르겠네요. 조언 부탁드립니다.    

PCR에 2.5mM dNTP 2ul 넣게 되어있는데 실수로 2mM dNTP 2ul 를 썼네요. PCR에 영향을 많이 미칠까요? 중단하고 다시 mixture만들어서 하는게 나을까요?

PCR 효율을 확인하기 위해 DNA sample을 1~10^-4까지 희석해서 5 points로 준비하고(각각 3 반복) Standard Curve type PCR을 진행하고  STD를 보면 R^@ 값도 0.999거나 1이고 효율은 90~110 사이로 나옵니다. melt curve도 단일 peak으로 sharp하게 나왔구요 3반복한 동일 sample끼리도 오차가 거의 없는 것을 확인하였습니다. primer는 GAPDH랑 cytokine용이 있는데 모두 위와 같이 나왔습니다.   그런데 cytokine 유전자 발현량을 비교하기 위해서 Housekeeping gene은 GAPDH로 하고 발현량을 비교할 cytokine이랑 같이 comparative ddCt type PCR을 진행하면, 항상 오차 값이 크게 나옵니다. 25씩 나올 때도 있을 정도로... real time pcr에서 오차가 크게 나오는게 피펫팅 때문인게  가장 크다고 알고 있는데요 mixture 준비하는 방법, 비율, 실험 과정 등등 모두 동일한데 왜 STD는 문제 없이 잘 나오는데 ddCt 비교할 때만 오차가 저렇게 나올까요

1번 probe FAM-BAQ1 2번 probe TAMRA-BHQ2 3번 probe Cy5-BHQ2 이렇게 짰는데 보통 5’FAM-3’TAMRA 이렇게 짜더라구요.. 근데 제가 짠것처럼 5말단에 각각 FAM, TAMRA이렇게 달아서 해도 될까요?? 그리고 dye에 따라 sensitivity가 다른가요??

DNA 추출시 100% ETOH로 워싱 후엔 pellet이 보였는데,그 후에 centrifuse 13000rpm 5분 후 상층액에서 70% EtOH로 워싱하면 pelet이 안보이는데 어떻게 하면 되나요?? 혹시 전 처리에 문제가 있을까요?

1 ug의 RNA로 cDNA를 합성합니다. (total volume 20 ul) 그럼 1 ug/20 ul의 cDNA가 합성되었다고 가정하고 이 중 1 ul을 Real time PCR을 하기 위해 사용하고자 합니다 mixture의 total volume은 1 rxn당 20 ul이구요.   그럼 1 rxn (20 ul)에  (1) 총 50 ng의 cDNA가 사용된다고 보면 되나요? (2) 아니면 2.5 ng의 cDNA가 사용되는 건가요? Real time PCR 1 rxn당 DNA 양은 1~10 ng이 적당하다고 알고 있어서 (1)이 맞다면 cDNA를 더 희석해서 사용해야 하려고 합니다.