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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. E.coli pLysS로 (Freeze & thaw) 하시는분 있나요?
안녕하세요. 저희는 pLysS가 들어있는 E.coli에 DNA cloning하여 Freeze&thaw법으로 세포벽을 깨고 있습니다.   언제부턴가 이게 전혀 되질 않아서 질문 드립니다....   이런 방법을 택하신 분들 중에 어느순간부터 cell이 거의 안깨지는 경험 해보신 분들 계실까요?   클로닝 안한 pLySs만 따로 키워서 넣어봐도 최근들어서 거의 안깨지는 현상이 있습니다...
회원작성글 딱풀  |  2021.12.28
Q. 그람염색 보고서(균이 안나옴) 첨부파일
과학고등학교 학생인데...2인 1조로 팀원이 그람 음성균, 제가 그람 양성균을 맡아서 실험하였습니다. 저는 결과가 잘 나왔는데 팀원이 6번이나 실험을 하는 동안 사진처럼 균조차 나오지 않았더라고요..균이 있고 염색이 이상하면 오차분석에서 할 말이 많은데 이런 상황에서는 어떻게 해야할까요...선생님이 까다로워서 감점은 당할거 같은데 혹시 그람 음성균 사진 가지고 있으신 분이나 아니면 균이 안나올수도 있는 이유 좀 설명해주실 수 있으신가요?
회원작성글 찐11111  |  2021.11.29
Q. 세포증식실험
PBMC를 Concanavalin A로 자극한 다음 MV 또는 Exosome (EV)를 3 농도 ( 50%, 25%, 12.5%) 추가한 조건에서 세포의 증식 분석실험 알려주세요
회원작성글 Wihrbjjsjj..  |  2021.11.26
Q. tunel assay
tunel assay 결과를 형광현미경으로 관찰했는데 왜 염색하지도 않은 빨강색이 염색되어 나오는걸까요??
회원작성글 assfgghjj  |  2021.11.23
Q. 유산균 sonication condition
현재 유산균 내 효소관련해서 연구 중인 대학원생입니다. sonication을 통해 유산균 cell을 파괴하려고 하는데 여러가지 조건으로 처리를 해봐도 열이 굉장히 많이 발생하더라구요. ice chamber에 넣고 하는데도 뜨겁던데 적절한 조건을 잡기가 힘드네요...고수님들의 도움이 필요합니다.
회원작성글 ArenaNova  |  2021.11.22
Q. 동물실험할 때 annexin V/PI staining 사용할 수 있나요?
동물실험할 때 apoptosis 확인하는 용도로 annexin V/PI staining 사용할 수 있나요? 사용할 수 있다면 어떻게 사용해야 하나요?
회원작성글 문어빵잉  |  2021.11.17
Q. Cell lysis 관련해서 고생하는 초보대학원생 입니다. 전문가 분들의 의견 부탁드립니다
안녕하세요. cell 실험을 하고 있는 대학원생입니다. cell lysis를 진행하고 나서 bradford assay로 정령 한 후에 protein 농도가 계속 낮게 나오는 데 여러가지 조건을 바꿔가면서 해도 아직까지 헤메고 있는 중이네요ㅠ 실험실에 있는 선배 분들이 주는 조언대로 이것저것 시도해보고 있는데 자꾸 원하는 결과가 나오지 않아 웨스턴 블랏 실험을 진행하지 못하고 있어서 답답한 실정입니다 키우는 cell은 U2OS입니다 (연구실 선배들은 HeLa와 비슷하게 생각하면 된다고 하더군요) 저희 연구실에서 대부분 쓰고 있는 100%cell confluecy는 35ml 기준 0.8 x10^6 60ml dish 기준 1.6x10^6 100ml dish 기준 4.8x10^6 (Culture dish는 SPL사꺼 쓰고 있습니다) 우선 cell은 RIPA buffer로 깨고 있습니다 RIPA buffer는 2X stock을 만들어 lysis 시 D.W와 inhibitor를 처리하여 dilution 후 사용 중입니다 (이것도 문제나 되나 싶어 의문이 들더라구요ㅠ) 2X 조성은 100mM Tris-cl(pH 7.5) 300mM NaCl 2% NP40 1% SDC 0.2% SDS 이고 여기에 NaF 5mM NaV 100uM EDTA 2mM PMSF 1mM Protease cocktail 1X 넣고 쓰고 있습니다 35ml dish(또는 60ml dish)에 40%-50% confluency로 cell seeding 해서 키우고transfection 후 24h(또는 36h) 후에 harvest 하여 lysis 합니다 혹시나 cell이 적은 것 아닌가 하여 harvest 하기 전에 dish를 현미경으로 보면 꽉 차 있습니다 lysis 과정은 1)우선 dish에서 배지 제거 2)PBS로 wash 후 pbs 넣기 3)cell scraper로 dish를 긁은 후에 1ml pipette으로 e-tube에 옮겨담기 -> 이 때 tip을 보니까 tip벽에도 cell이 붙어서 loss가 생기는 것 같기도 하더라구요 tip에 안 붙게 하는 방법을 찾아도 안나오고 다들 별 신경안쓰고 하는데 저만 안 되니까 이런 부분도 생각을 하게 되었습니다그렇다고 이 loss가 단잭질이 안 나올만큼 인지도 모르겠습니다ㅠㅠ 4) 2000rpm, 4℃, 5min swing rotor centrifuge 돌려서 pellet 만들고 상층액 pbs 제거합니다 -앞 단계에서 배지 제거 후에 pbs wash를 안하고 pbs 넣은 상태에서 cell을 긁은 적도 있는데 이 때는 pbs를 pellet까지 다 제거하지 않고 약간 남겨서 pellet을 200ul pipette으로 resuspension한 후e-tube에 pbs 채워서 4) 조건과 동알하게 centrifuge 돌립니다 5)그리고 pellet에 RIPA buffer를 넣고 pipetting을 30-50회 정도 하여 pellet을 풀어줍니다 -> 여기서도 헷갈리는 게 저희 연구실은 35ml 꽉 찬 dish를 RIPA 30-50ul를 넣고 깨더라구요 구글 서치를 해보고 다른 분들 이야기 들어보니까 35ml dish 깨는데 100ul정도를 넣고 깬다고 들 하긴 하던데 뭐가 맞는 건지 잘 모르겠더라구요 어쨌든 RIPA를 50ul 넣는다고 lysis가 안될 꺼 같지는 않고 오히려 단백질 농도가 더 높게 나오겠지 싶어 일단 50-80ul 사이에서 저는 진행을 합니다 ->그리고 어떤 분들은 RIPA를 dish에 뿌리고 scraper로 긁어준다고도 하는데 저는 그렇게 안해보기는 했는데 그렇게 하는 것이 더 좋은 방법인건가 궁금합니다 6)pipetting 한 lysate를 ice에서 5분-30분 incubation을 합니다 ->처음에는 5분 했다가 단백질 농도가 안 나온다고 실험실 선배께 말씀 그렸더니 5분->10분->20분->30분까지 올린 건데(구글에 찾아보니 30분까지 하는 경우도 있긴하던데 이게 일반적인 것인지는 잘 모르겠습니다) 단백질 정량 후에 별 차이가 없어서 어떻게 하는 게 좋을지 잘 모르겠습니다 너무 오래하는 걸로 조건을 잡으면 protein degradation이 일어나거나 하지 않을까 싶어서 염려되기도 하여 고민이 됩니다 -> 그리고 어떤 글을 읽어보니 incubation 하면서 voltex를 해준다는 말도 있는데 voltex를 하려면 아이스에서 상온으로 온도변화가 생기는 데 이게 필요한 걸까요ㅠ 7)sonication을 진행을 합니다 저희랩에서 쓰는 sonicator는 tip을 쓰지 않고 얼음물에 e-tube를 담가놓으면 아래쪽에서 초음파가 나와 sonication이 되는 장비입니다 저희 랩에서 쓰던 조건은 Amp 80 pulse-on 10sec pulse-off 10sec Total time 2:00(12번 정도 sonication 해주는 것) 인데 혹시 sonication 때문인가 싶어서 구글 찾아보니 Amp 60 pulse-on 15sec pulse-off 45sec Total time 30sec(2번 sonication) 정도로 하면 괜찮다는 이야기를 들어서 이렇게 바꿔보고 실험도 진행해 봤습니다 근데 이것도 단백질 양에는 별 차이가 없더라구요ㅠ 8) 13,000rpm, 4℃. 10min fixed angle centrifuge 돌리고 상층액 따서 bradford 정량 합니다 9) bradford 정량 -> 처음엔 제가 RIPA를 쓰니까 detergent가 들어가서 정량이 잘 안되는 문제인가 싶었는데 실제로 저희 연구실에서는 1/10 dilution 해서 흡광도를 측정하는 거라 이게 큰 문제가 되는지 싶더라구요 -> Bio-rad사 protein assay bradford 용액을 쓰는데 저희랩에서는 1ml bradford 용액에 lysate 20ul 넣으면 완전 정확한 것은 아니지만 흡광도가 단백질 농도와 거의 같은 값으로 나와 실험실 다른 분들은 평시에 1/10 양으로 2ul 따서 측정을 합니다( 저는 detergent 고려해서 희석해서 3ul+D.W 27ul 넣고 섞어 준 뒤 20ul를 넣고 측정 합니다) -> 그래서 실험실 선배들 이야기 들어보면 50ul 넣고 깼을 때 흡광도 0.3 나온다고들 하더라구요(0.3x 10=3mg/ml) 저는 그것에도 훨씬 못 미친 0.05-0.1이 나오는 상황 입니다 -> 제가 교수님께도 지적받는 부분이기도 하고 구글에 찾아봐면 35ml dish 깨면 300ug 정도 extract가 나온다고 하는데 그러면 100ul volume의 lysis buffer에 깨도 저희 랩에서 사용하는 방법 대로하면 흡광도가 0.3 정도 나오는 게 맞는 거 같은데 아닐까요?ㅠㅠ -> 제가 얻는 흡광도를 기준으로 20ug loading 했는데 western bnad도 안나옵니다ㅠ 너무 답답한데 실험실 분들도 명쾌한 답을 주지 못해 브릭에 질문드리게 되었습니다 실험 과정에서 제가 놓치고 있는 부분이 무엇인지 전문가 분들의 성심있는 조언 부탁드립니다 초짜 대학원생 구제 부탁드립니다ㅠ
회원작성글 cell실험입문석사  |  2021.10.25
Q. H295R cell N/A MTT assay
세포 실험 전 세포가 잘 깔리는지 확인해보기 위해 아무런 시약을 처리하지 않은(N/A) MTT 측정을 하려고 합니다.   실험 방법은 다음과 같이 진행하려고 합니다.   1. 세포를 24-well에 깔아둔 뒤 ending 날 기존 차콜미디어 제거 후 MTT 시약을 추가하여 1 시간 incubation   2. MTT 시약 제거 후 DMSO를 첨가하여 보라색이 되는 것을 관찰   3. 보라색이 관찰 된 시약을 적정량 따서 96-well plate에 옮긴 뒤 흡광도 측정   lab마다 protocol은 다르겠지만 위의 방법처럼 24-well plate에 진행한 경우 시약을 따서 96-well plate에 옮기는게 맞을까요..?   그리고 N/A MTT assay의 경우 아무런 시약을 첨가하지 않고서 측정하는거죠..?
회원작성글 dkaneh  |  2021.10.18
Q. 24 well plate cell lysis
24 well에 키운 세포를 lysis 하려고 합니다. 방법 확인 검토해주세요.   1. 각 well에 lysis buffer 100 ul넣기 2. 얼음위에 10분간 두기 3. 팁끝으로 plate 긁기 4. e-tube에 모으기
회원작성글 juyu21  |  2021.10.02
Q. 96-plate centrifuge
96plate에서 배양한 cell을 lysis하여 상등액을 얻으려고 합니다. lysis buffer를 넣고 centrifuge하려고 하는데 3000 rpm으로도 상등액을 얻을 수 있을까요?
회원작성글 juyu21  |  2021.08.27
Q. hek 293 cell 세포 형태학 측정 실험 할 때
특정 식물 추출물의 암세포 독성을 알아보고 싶어서 연구 중입니다. hek 293 cell에 대해 live cell stain 할 때 mtt나 다른 실험이랑은 다르게 살아있는 세포 비중이 농도에 따라 갑자기 너무 줄어들었습니다. 원인을 잘 모르겠어서 질문 올립니다.
회원작성글 민뚱  |  2021.08.17
Q. 세포 분획법 소기관 확인
원심분리에 의한 세포분획법을 한 후,   해당 세포 소기관을 확인하는 방법이 어떻게 되는지요?   고등학교 교사인데 동아리 시간에 세포 분획법을 해볼까 해서 질문합니다.
회원작성글 flyinskys  |  2021.08.17
Q. 동물세포주 NAD+/NADH ASSAY 샘플준비과정 조언 부탁드리고싶습니다.
안녕하세요, 동물세포를 가지고 NAD 정량 및 NADH랑 비율을 재는 실험을 하고싶은데, 신생연구실이기도 하고 딱히 정보가 없어 혹시 조언을 여쭙고자 질문 올립니다. (재탕입니다.) K-337 BIOVISION의 KIT 를 구매하였습니다. 제가 궁금한것은 프로토콜상에는 10kDa MWCO 필터를 사용해서 세포내에 있는 엔자임을 거르는것을 추천한다 라고 써져 있는데 1. 실험실 보유 MWCO가 3kDa 까지 밖에 없는데 사용해도 되는지와, 가지고 있는 키트는 한개이고, day 2 와 day 6 의 값을 보고싶은데, 세포를 최대한 fresh한 상태에서 assay를 하길 권장한다라고 되어있긴한데, mwco까지 거른 상태의 nad/nadh extration solution 상태로 보관한 후 reactioon mixture를 넣어줘서  한번에 d2와 d6 의 흡광도를 봐도 문제가 없을시 궁금합니다..! 여러 문헌을 보았을때, serum이 없는 media 내에서도 별 다른 분해가 일어나지는 않는것 처럼 보이는데, extration buffer등이 분해를 유도할 수 있는지는 잘 모르겠습니다.. 답변해준시다면 정말 감사하겠습니다.
회원작성글 하기스팬티  |  2021.08.02
Q. muse 결과자료 해석 질문 너무 궁금합니다 첨부파일
안녕하세요 현재 실험실 다니고 있는 3학년 학부생입니다. muse 사용법을 익히는 중 이해가 안 되는 점이 있어서 질문드립니다. Annexin V를 사용해 live, early, late apoptosis, dead cell의 분포를 그래프로 결과가 나오는데 여기서 가로축이 Annexin V인 것은 이해가 됩니다. 근데 세로축이 Viability인 이유는 무엇인가요? 제 생각에는 Viability가 1, 2, 3, 4로 올라갈수록 live cell이 많다는 거 같은데 좌측 하단이 live, 좌측 상단이 dead cell로 되어 있더라고요.
회원작성글 curio  |  2021.07.30
Q. 백혈구를 8000G로 돌려버렸습니다..
안녕하세요. 제목그대로 원래 800g 10min인데, 새로들어온 원심분리기가 80으로 입력해야 800인것이더라구요. 그걸늦게발견해서 800을 입력했으니 8000G로 돌았고, Rpm이 9000정도 되버린겁니다. 백혈구를 모아서 터트려 여러가지 효소양을 보는실험인데 워싱전에 그렇게 해버렸으니 셀에 데미지를입어 다 터져버렷다면 워싱단계에서 효소가 다 씻겨져 없어져버렸겠죠? ㅠㅠ 우선 pellet 분리는 잘됐고, 실험결과도 괜찮게나왔는데 그사실을 늦게발견해서... 데이터로 아예 쓸수없는건지 궁금합니다.. 만약 다 터져서 효소가없다면 실험결과도 안나왔을텐데 또 측정해보면 검출은 다되서요....
회원작성글 압타머11  |  2021.06.25
Q. 100 pi dish cell lysis
안녕하세요. cell lysis 실험을 6 well에 cell 배양해서 진행을 했었는데 6 well이 아닌 100 pi dish로 진행하려고 합니다. 100 pi dish는 바닥이 잠길 정도로 배지를 넣어서 subculture를 하면 될까요?  그러면 최소한 몇 mL 배지를 넣어줘야 하는지 궁금합니다....  
회원작성글 96호  |  2021.06.24
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