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Q. stem cell seeding 부착문제 or Cell death
안녕하세요 석사과정 2년차 대학원생 입니다ㅠㅠ 지금 3일째 hESC(human stem cell)을 풀었다가 다시 시도하는 것을  반복중입니다.... -80도 deepfreezer에 2017년도에 얼린 cell을 matrigel coating된 well에 풀었습니다.  근데 hESC들이 부착되지 않고 대부분 single colony가 되어  둥둥 떠다닙니다...  부착이 되지 않은 것인지, cell들이 다 죽어서 떠다니는 것인지ㅠㅠ 3일동안 너무 스트레스 받네요ㅠㅠㅠ   stem cell에 대해서 잘 아시는 분 계실까요?
회원작성글 약대석사응애  |  02.05
Q. midi prep 이후 plasmid electrophoresis했을 때 이상한 밴드가 나옵니다. 첨부파일
선생님들 안녕하십니까? 학부생입니다. 현재 plasmid를 DH5a cp cell에 transformation해서 midi prep한 다음 confirm하는 과정을 진행중인데요. 이상한 밴드가 계속 나와서 머리가 아픕니다...   gel은 0.7%고 non-cut plasmid입니다. plasmid가 맞는지만 적당히 확인하기 위해 cut은 안했고요. 사진에서 2번레인이 이전에 쓰던 것이고 (stock) 3,4 번레인이 새로 midi한건데  위쪽의 supercoil이나 nick 이런 밴드는 알겠는데 밑에 100-300bp?에 이상한 밴드가 눈에 보일정도로 진해졌네요. 자세히 보면 맨 윗밴드도 진해진 것 같고요. 이 밑에 밴드가 뭔지 모르겠습니다. 이전 랩에서 midi하면서 이런 밴드를 본 기억이 없는데.. contamination된건지?    260/280값이 조금 높게 나오기는 하는데 (1.9이상) 이건 stock midi했을 때에도 마찬가였습니다. 아마 midi에 쓰는 buffer가 오래된 거라 그런 것 같은데.. 그걸 감안해도 눈에 보이지 않던 밴드가 진해져서 머리가 아프네요.   제가 생각하기에는 gDNA나 RNA가 섞여있거나 (당연히 Sol1에 RNase A 처리하고 4도씨 보관, 실험중에도 ICE보관하면서 했습니다) plasmid denaturation이 되어서 single strand가 나왔거나(이전에도 똑같이 inverting하고 lysis 5분했는데 왜..) 하는 것 같은데 이걸 어떻게 해야 할 지 모르겠습니다.  transfection할 때 사용할 거라 이상한 것 같으면 처음부터 그냥 새로운 CP cell 까서 buffer까지 새로 바꿔버려야 할지... RNase나 enzyme cut을 시도해봐야 할지 고민입니다. 만약 RNA contamination이라면 RNase를 처리하고도 293T에 transfection 할 수 있는지도 궁금합니다. 사용한 midi kit는 N*****B**** kit입니다.  이전에 Q사에서는 이런게 보이지 않았던 것 같은데.. 아무리생각해도 잘 모르겠네요. Neutralization 이후 ICE incubation과정이 없어서 그런건지..   도와주세요 선생님들.. 
회원작성글 큰곰인형  |  02.05
Q. 반복수 질문 (기초..)
안녕하세요. 데이터 정리 도중에 기본적인 질문이 있어서 올립니다! cell proliferation을 보려고 1,2,3,4일차 cell counting을 하고 cell doubling time을 계산했는데 3->4일차 1반복이 다른 값에 비해서 많이 튄 것을 확인했습니다.  1. 이 값을 빼고 2,3 반복수로만 데이터를 정리할지 고민됩니다.  2. 그래프를 그렸을때 1반복 그래프 모양이 다른 cell proliferation graph와 비슷한 형태를 보여서 이게 더 정확하게 값이 나온것인지,, 다른 2,3 반복수는 1일차에서 seeding한 세포수에 비해 줄어들었지만, 비슷한 그래프 모양을 띠었습니다. 정리하자면, 어떤 데이터를 빼고 어떤 데이터를 써야할 지 모르겠습니다. ㅜㅜ
회원작성글 미생이  |  02.05
Q. siRNA Transfection 후 western blot 밴드 변화
siRNA 처리 후 6시간 뒤 Media Change 진행 후 48 시간 뒤에 Harvest 하여 진행하였습니다 Havest전 cell morphology상에서 transfection이 확실하게 이루어 진 것은 확인하였으나 westen blot band상에서는 control과 siRNA의 차이가 전혀 없습니다 Media change하고 시간을 48시간 보다 더 두어보는 것이 방법일까요?? 도움 좀 얻고 싶습니다
회원작성글 uuy  |  02.05
Q. protein purification 중 binding 문제
안녕하세요, protein purification 실험 진행하는데 막히는 부분이 있어 여기에 여쭤봅니다.  단백질 실험은 처음 해보는지라 모르는 점이 많음을 양해 부탁드립니다.    target 하는 단백질 size 는 대략적으로 28kDa(his tag size 포함) 이고, Ni-NTA resin 을 이용하는 Affinity chromatography 를 통해 정제하려고 하였습니다. 사용한 Tag은 His-tag이며, N-term과 C-term 양쪽에 모두 6x His를 가지고 있습니다 (N-term이 stable 하다는 얘기를 듣긴 했지만, 양쪽에 his tag를 가지고 있으면 binding 이 더 잘될 것이라는 생각이 들어 N/C -term 모두에 his-tag를 달았습니다.) 실험 방법은 다음과 같습니다.  1. 25ml 의 cell culture를 centrifuge하여 pellet 을 수득한 후, lysis buffer 5ml 로 resuspension 한 다음 세포파쇄 (via sonicator: 50%, 5'' on/ 5'' off)하였습니다. sonication 이후 centrifuge 하여 supernatant를 lysate로 사용하였습니다. (soluble fraction)  2. 사용할 column (10ml의 컬럼)을 1CV 만큼 equilibration 해주었습니다.  3. Ni-NTA agarose resin 을 column에 1ml 충진 후, binding buffer 3CV flow through.  4. Sample 을 column에 load 한 후, 4℃ 에서 rotation 준 상태로 O/N 5. 이후, Sample을 flow through 하였습니다. (이 때 binding 을 좀더 시키기 위하여 flow through한 sample을 약 3회 정도 re-load하여 최종 Sample flow through 를 확보하였습니다.  6. (+10mM imH)로 3CV 만큼 washing  7. 1CV의 50mM~500mM imH로 각각 elution  8. SDS-PAGE 로 gel 확인 (Gel 사진은 하기 그림과 같습니다/ 하기 문제점에 기재하였듯, Elution 된 양이 적어 50mM 이상 elution 하였던 lane은 그림에서 뺐습니다.)  문제점과 질문사항은 다음과 같습니다.  Issue 1. Sonication 시, 많은 양의 cell 이 깨지지 않음이 확인됩니다. 우선적으로 사용한 sonication의 조건은 general 하게 사용하는 condition 으로 수행하였습니다. 질문) sonication 시 cell 이 잘 안깨지는 이유가 무엇인지 여쭤보고자 합니다. (많은 양의 cell 이 깨지지 않았더라도, 현재 gel 상 Soluble faction 에서는 충분한 target protein이 확보되었기 때문에, 큰 문제는 되지 않겠지만.. 그래도 일반적인 lysate와는 turbidity 가 많이 차이나서 여쭤봅니다.) Issue 2. Soluble fraction 과 Sample flow through 에서 target 단백질의 size 가 거의 비슷합니다. -> Ni-NTA Binding의 문제라고 생각됩니다. binding 효율을 늘리고자 4도에서 rotation 주며 o/n 하였으나 실질적으로 target 단백질이 이 과정에서 많이 손실되는 것으로 보입니다. 따라서, elution 시에도 당연히 target 단백질이 적게 수득됩니다. (  질문) binding 이 잘안되는 경우, binding 효율을 늘리기 위하여 어떤 방법들을 사용하시는지 여쭤보고 싶습니다. 또한, gel 사진을 해석하기에 또 다른 문제점들이 있는지를 알고 싶습니다.  ** binding이 안되는 경우, 보통 3차 구조로 his tag이 숨어버리는 경우를 의심하는 것으로 알고 있습니다. 이런 숨는 케이스를 확인하고자 하면, 어떤 방식으로 확인해야 하는지도 여쭙고 싶습니다.   감사합니다. 
회원작성글 ATTENSION  |  02.04
Q. 관리된 소 조직 구할 수 있는 방법이 있을까요?
소(bovine) 조직 내 물질을 분석하는데 검량선 그릴때 blank조직이 필요해서요.. 열심히 찾아보는데 서칭능력이 부족한지 안나오네요.ㅠ 진짜 어디 도축장 발품을 팔아야하는지..
회원작성글 fbtpa4  |  02.04
Q. Immunoprecipitation 후 immunoblot 결과 해석
논문을 보던 중 Western blot 결과 해석이 어려워서 질문드립니다ㅠㅠ... 질문은 크게 두가지입니다.   예를 들어, A단백질은 B, C, D와 complex를 형성한다고 했을 때, [질문1] Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 A 단백질을 Immunoprecipitation 후, B,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 컨드롤(scrambled control)에 비해 B의 증가량이 C, D의 증가량에 비해 매우 크다는 것은 무엇을 의미하나요? [질문2] 위 질문의 연장선으로,, Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 B 단백질을 Immunoprecipitation 후, A,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 위의 질문결과와 다르게, A,C,D의 증가량이 유사했다는 것은 무엇을 의미하나요?
회원작성글 옹듸  |  02.04
Q. western blot band 개선 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ
western blot을 진행하고 있는데 아래사진처럼 dot 처럼 나오는 문제의 원인을 파악하지 못해서 이렇게 질문드립니다.... 단백질 사이즈 ; 14,16kDa 15% SDS-PAGE, Bio-rad 사용 Running ; 100volt, 2h 30min   Transfer ; 100volt, 1h 일단 이런식으로 dot으로 나오는 게 아래의 작은 size 단백질만 그렇고 GAPDH나 다른 사이즈 단백질은 크게 문제 없이 나옵니다.... 작은 사이즈의 단백질에 대해서 해당문제를 해결하려면 어떻게 해야하는지 도움부탁드립니다..
회원작성글 뚜둥  |  02.04
Q. qPCT Tm값
안녕하세요. qPCR을 처음 해본 학부생입니다. qPCR 진행 후 Tm값 결과를 얻었는데, PCR mixture가 약간 부족했던 튜브만 Tm값이 살짝 다른 위치에 나왔는데 Tm값과 PCR mixture volume이 어떤 관계가 있는건지 궁금합니다!! PCR mixture 양이 아주 달랐던건 아닌데 이거 말고는 원인이 없는거 같습니다… 너무 궁금해서 계속 찾아봤는데, 구글링해봐도 잘 모르겠습니다ㅠㅜ 아직 부족한 부분이 너무 많습니다. 너그럽게 이해해주시고, 알려주시면 정말 감사하겠습니다 !!
회원작성글 영혼가출중  |  02.04
Q. 실험하다답이안나와요
1번 100pmol primer를 10pmol 로 희석을하고 10pmol에서 3.2pmol을 만들려면? 2번 PCR밴드가 끌리면? 어떻게 해야하죠?
회원작성글 콩콩콩콩  |  02.03
Q. 푸른곰팡이 배양 및 streaking 질문입니다
제가 푸른곰팡이를 배양하려 하는데 귤껍질이나 상한 음식에서 푸른곰팡이가 자라나면 포자를 루프로 때어내서 바로 배지에다가 접종시기면 될까요..?
회원작성글 란울  |  02.03
Q. 전체(항생제 미사용을 말하는 겁니다) 미생물상 배양법?
안녕하세요. 개미 표면에 상주하는 박테리아 종류가 뭐가 있는지 알아볼려고 하는데요. 당면한 문제가 2가지 있습니다. metagenomics는 비용 문제로 쓰지 못하므로 관련 내용 언급은 삼가주세요.   1. 개미 표면에서 어떻게 혼합균주를 떼어낼 수 있을까요? 개미를 핀셋으로 잡아가지고 그대로 배지에 문지를 수도 없고 말입니다. 2. 1.을 해결하기 위해 한 가지 방법을 생각해 봤는데요, 다음과 같습니다. 희석한 생리식염수나 3차 증류수를 살짝 묻힌 멸균 면봉으로 개미 표면을 닦아낸 후, 그 면봉 끝을 액체배지에 담갔다가, 그 액체배지를 3일 후 다시 고체배지 위에 도말한다   인데... 뭔가 이래도 되나 싶기도 한 방법이라.... 이렇게 해도 될까요?  그리고 1. 질문도 답변 부탁드립니다.
회원작성글 jaehunjeon..  |  02.03
Q. cell doubling time 질문
안녕하세요. 세포 증식 실험을 하던 중 의문점이 생겨 질문 남깁니다. cell counting을 이용해서 cell doubling time을 구하려고 하는데  5000(0h) 4500(24h) 6800(48h) 22500(72h) 44300(96h) 24시간 주기로 세포 수를 counting 했을 때 이렇게 나왔습니다.  1. 0h-> 24h 에서 5000개를 seeding했는데 부착이 되지 않은 세포가 있는지 4500개로 세포 수가 줄었습니다. 이 때, doubling time이 -가 나오는데 이런 경우에는 어떻게 해야되는 지 궁금합니다. 2. cell doubling time을 구할 때, 0->24h, 24h-> 48h, 48h-> 72h, 72h-> 96h 각각의 doubling time을 구해서 평균을 내는 것인지 궁금합니다. 너무 기본적인 내용이지만 답변해주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 미생이  |  02.03
Q. TOC 분석 시험 의뢰 기관 문의
안녕하세요 : )  TOC 분석 관련하여 정보가 필요해서 문의글 남깁니다.   1 ppb까지 시험이 가능한 기기로 5ppb 이하의 시험성적서를 발행할 수 있는 KORAS 분석시험기관을 서치 중입니다.    혹시 알고계시는 분 있으시면 답변 부탁드립니다.  감사합니다 : ) 
회원작성글 됴엥  |  02.03
Q. Western blot 발현량 측정 방법 질문드립니다.
안녕하세요. 공부 중에 궁금하여 질문드립니다.. 웨스턴 블롯이 타겟 단백질이 있는지 없는지 유무를 확인하는 방법이라고 이해를 하였는데요   혹시 RNA 발현량 알아보는 qPCR 실험 같이 타겟단백질의 발현량(?)을 확인하는 정량 실험은 어떤 방법이 사용되나요? 어떤 실험법으로 찾아야 공부할 수 있는지 몰라서 질문드립니다 ㅠㅠ  
회원작성글 흰털누누  |  02.03
Q. plasmid DNA transfection model, miRNA 실험 질문
reference를 찾으며 실험 모델을 찾아보다가 궁금한 점이 생겨서 질문드립니다. miRNA가 target gene의 3'UTR에 binding해서 gene expression을 조절하는 것으로 알고 있는데요. 어떤 A라는 gene이 많이 올라가 있는 상태에서 A gene억제조절하는 것을 보고싶은데 A plasmid DNA를 직접 transfection 시켜서 overexpression을 시키면 DNA에는 3'UTR이 없기 때문에 모델로서 적합하지 않은걸까요? overexpression model을 잘 안쓰고 다른 toxin으로 해당 gene을 올리는 방법으로만 쓰길래 질문드립니다. 감사합니다!
회원작성글 2밍  |  02.03
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