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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. western blot 실험 GST band가 안 나온 이유
제가 아직 공부 중인 편입생이라 너무 헷갈려서 질문 남겨봅니다.. 학교에서 western blot 실험을 진행했습니다. 근데 나온 결과를 보니 beta-actin band는 잘 나왔는데, GST band는 나오지 않았습니다. 제가 생각하기론 단백질과 bead가 binding이 되지 않았거나 2차 항체가 붙지 않아서 보이지 않는 걸까요..? GST band가 계속 나오지 않네요ㅠㅠ GST band가 나오게 하기 위해서는 어떻게 해야하는지 궁금합니다...실험 처음 과정에서 부터 문제가 있었던 것일까요?
회원작성글 뚱때지  |  2022.11.23
Q. cell harvest
WB sample 만드는 과정에서 cell을 harvest 하기 전 pbs 워싱 단계에서 질문 있습니다. lysis 하기 전에 한번 정도 워싱을 하는데, 이때 샘플마다 pbs를 1ml, 2ml 정도 다르게 넣고 워싱을 했는데 정량에 문제가 있을까요 ㅜ
회원작성글 오이가싫어  |  2022.11.22
Q. western blot시 band size가 target protein과 다르게 나옵니다
안녕하세요. western blot을 배우기 시작한 대학원생 입니다. 이번에 western을 했는데, target protein과 너무 다른 size에서 밴드가 떠서 질문을 드리게 되었습니다. target protein의 분자량은 약 30kDa이고, primary antibody의 data sheet에도 32kDa라고 나와있습니다.  근데 western 결과를 확인해보니 약 70-80kDa 정도에서 밴드가 떴습니다. sample을 약 20개 정도 찍어봤는데 전부 해당 size에서 밴드가 확인됐습니다.  혹시 왜 이렇게 나오는지 설명해주실 수 있으실까요? 찾아보고 있고, 계속 찾아볼 예정이지만 혹시 도움을 받을 수 있을까 해서 여쭤봅니다.  감사합니다!
회원작성글 주먹밥김  |  2022.11.22
Q. cell, tissue의 단백질 사이즈가 다를 수 있나요?
monoclonal 항체를 이용하여 cell(skeletal muscle cell), tissue(skeletal muscle) lysate를 이용해 웨스턴을 했는데, cell에서는 원래 사이즈가 맞게 나왔는데 tissue에서는 사이즈가 다르게 나오더라고요 이럴 수 있나요? whole membrane에 항체를 붙였고, 원래 사이즈가 150인데 tissue에서는 60 언저리 정도로 나왔습니다..
회원작성글 별헤는밥  |  2022.11.22
Q. western blot gel 찢어짐 질문이요..
안녕하세요 선배님들ㅠㅠ western blot transfer 할 때 gel이 찢어졌는데 최대한 티 안나게 다시 붙여서 우선 transfer은 진행하였습니다ㅠ 이런 경우에 찢어진 부분이 티가 많이 날까요... 저와 같은 경험이 있으신 분들은 알려주세요..ㅠㅠ!
회원작성글 ㄹㄹ  |  2022.11.22
Q. 단백질 전기영동 밴드 끌림 현상 관련 질문드립니다.
안녕하세요  단백질 전기영동 실험을 진행하고 있는데,  계속 밴드 끌림 현상이 생기고 있고 ㅠㅠ 여러 troubleshooting을 진행해보았으나 소용이 없어서 western blot 고수님들의 조언을 구하고자 합니다.    실험 조건은 다음과 같습니다.  1. C57BL/6 마우스 대장 조직 homogenate(상등액) 2. lane당 단백질 20 ug  3. Homogenate 샘플을 SDS loading buffer와 섞은 후 100도에서 15분 가열  4. lane당 샘플 10 ul씩 로딩  5. 전기영동 조건 200 V, 35분  6. Gel: bio-rad  Mini-PROTEAN TGX gels (10%)    Running buffer도 늘 새로 만들어서 충분한 양을 넣어서 실험하고 있고,  Gel 밑의 테이프도 잘 떼어서 사용하고 있습니다.    사진도 첨부하였으니  조건과 결과에서 제가 혹시 놓치고 있는 부분이 있는지 코멘트해주시면 정말 감사하겠습니다!! 
회원작성글 ㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎ  |  2022.11.21
Q. NF-kB p65 항체
초보 실험실생입니다. 이번 WB 실험을 하면서 p65 항체를 phospholylation/total을 봐야해서 항체를 알아보고 있는데, polyclonal로 찾고 있습니다. sample은 mouse입니다 인산화 부위가 다른게 많던데 어떤 항체를 봐야하는지와 이유까지 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 문어체  |  2022.11.18
Q. lysis buffer 거품
Lysis buffer로 cell을 lysis 한 후 4도씨 냉장고에 10-30분 정도 둔 다음,  13000rpm, 10분에서 centrifuge를 한 후 sup만 따서 새로운 e-tube에 놔둡니다. 실험이 추후에 진행할 시 냉동고에 얼린 후  다시 녹여서 vortex를 진행하는데, vortex 한 후 spin down을 해도 거품은 사라지지 않았습니다.  혹시 거품을 최소화하고 정확하게 정량 하는 방법이 있을까요 ㅜ 
회원작성글 카스테랑  |  2022.11.17
Q. 백그라운드를 미친듯이 타고 밴드가 연한 현상,, 저 졸업 못할거같아요ㅜㅜ 제발 도와주세요,,
tnf-a를 보고있고 데이터 시트가 항체를 5% bsa에 희석하여 사용하길 권장하여 1:1000으로 사용 중에있습니다. 회사는 셀시그널링입니다!   항체를 skim에 사용했더니 시그널이 아예 뜨지 않아 bsa를 사용하고있고 그러니 잘 뜨긴했습니다.(왼쪽이 현재 상황, 오른쪽이 잘뜨던 날,,입니다.)   그런데,, 딱 한번만 잘뜨고 그 이후로는 밴드가 저렇게 백그라운드를 미친듯이 타면서 밴드는 연하게 뜹니다. 디벨롭을 조금만하면 아예 저것 조차 뜨질 않구요. 아주 강하게 하면 멤브레인을 태우면서 겨우 저정도 밴드가 보입니다..   블락킹은  프로토콜대로 스킴밀크에서 2시간 수행했고, 안티바디 1차는 bsa 1:1000 오버나잇 2차는 bsa로 1:4000을 붙이고 워시를 10분간 5번 수행했습니다.. 대체 뭐가 문젤까요,, ㅜㅜ 갑자기 왜 저렇게 백그라운드를 타면서 밴드는 연하게 나오는 걸까요,, 3일쨉니다. 같은 문제가,, 현재 스트리핑 중에있습니다. 새로 붙여보려구요,,   
회원작성글 진vv  |  2022.11.17
Q. 연구자 본인의 체액으로 실험 ,,, ?
안녕하세요   엑소좀 관련 연구를 준비하고 있는 석사 2학기생 입니다!!   슬슬 졸업 논문이 될 동물실험을 계획하고 있습니다. 이제 본 실험을 들어가면 웨스턴을 통해 exosome marker 확인도 해야하고, 또한 특정 조직 유래 exosome 마커를 활용한 2 step Exosome isolation 을 진행중인 만큼 해당 마커도 확인하기 위해 웨스턴을 필수적으로 연마해야 합니다. 하지만 현재 웨스턴 블롯이 아주 미숙한 상태라 많은 연습이 필요합니다. 2step exosome isolation 프로토콜 확인 및 웨스턴 연습을 위해 cell culture를 통해서 exosome을 취득하고 있는데, 문득 너무 비효율적이라는 생각이 들었습니다. 특히 오늘 ,, protein 정량을 위해 BCA assay를 진행했는데,,, 어디선가 날려먹었는지 cell culture 부터, 처음부터 다시 해야할 수도 있다는 생각에 이런 생각이 더욱 강렬하게 들더라구요,,,, cell culture medium을 통해 exosome을 취득하려면 그 양 자체가 적어서 많은 양을 키웁니다.(150mm x10, 이렇게 나온 exosome을 다 합쳐야 웨스턴 할만한 양이 나오더라구요 ,,) 또한 조직별로 구분하는 만큼, 조직의 수 만큼 더 많아지구요,,, 2~3조직으로 하면 150mm 30판,, 연구실이 작고 다들 바빠서 혼자 합니다 물론 혼자 하는게 당연한거긴 한데,, 그래서 그냥 제 소변을 이용하면 어떨까라는 생각이 문득 들었습니다.. exosome isolation 키트, 안티바디 모두 호환이 되서 당장 실현은 가능합니다만 너무 미친사람이 되어가는게 아닌가 우려가 되어서,, 혹시 저같이 본인의 혈액, 소변 등을 이용해서 파일럿 혹은 연습 실험하는 사람이 있는지 궁금해서 글 올리게 되었습니다... 아 물론 제 몸에 케미컬 인젝션은 안합니다,,,
회원작성글 사자돼지  |  2022.11.16
Q. 조직 단백질 웨스턴 도와주세요ㅜㅜ
마우스 골격근을 액체 질소에 얼려서 부수는 방법으로 균질화를 하고 있고 이후 Pro-prep이라는 lysis 버퍼 제품을 이용해 lysis 합니다. 프로토콜 대로 lysis 해서 protein을 추출한 뒤에 sample버퍼와 함께 95도에서 5분간 가열하여 로딩합니다. semi-transfer로 25V 40분 합니다. 중요한건 GAPDH, ACTIN은 잘 나오는데 제가 보려는 사이즈의 단백질(150kDa)이 너무 이상하게 나오거나 안나옵니다.. lysis가 문제인건지 sampling 할 때 온도를 좀 낮춰서 해야할지 모르겠네요.. 잘 모르는 놈 도와주시면 정말 감사드리겠습니다ㅠㅠ
회원작성글 별헤는밥  |  2022.11.16
Q. western blot 고수 분들 답변 부탁드립니다. 고질적인..(?) 문제에 대한 해석입니다.
안녕하세요. 선배님들   오늘도 western으로 고통받고 있는 대학원생입니다.   western으로 오랫동안 갈려나가면서 고질적인 문제들에 대해   속시원히 대답을 듣고 싶어 질문을 올리게 되었습니다.   랩의 특성 상 mouse tissue를 많이 사용하는데,   1) mouse 조직인데, 1차 mouse 항체 2차 mouse IgG를 사용할 때... 나타날 수 밖에 없는 잡밴드들과... 하필 타겟 밴드의 시그날이 약한경우..는 해당 western을 rabbit 같은 다른 source의 1차 antibody로 바꾸지 않는 이상 자체적으로 해결할 방법이 없을까요?? 하다못해 b-actin이나 a-tubulin이나 1차가 mouse monoclonal이고, 2차가 mouse이다보니.. 후 loading control임에도 밴드가 잘 뜨지 않고 해석이 가끔 힘든 경우가 너무 많아서 이런 경우에는 어떻게 보통 대처를 하시는지들 궁금합니다.   2) 위의 조건일 경우 저는 일반적인 western 방식 (running-> transfer 1 hr -> skim milk 1 hr ->1차(보통 1:1000) overnight ->1차 1hr 이상 washing -> 2차(보통 1:5000) 1hr~2hr incubate-> 1hr 이상 2차 washing 후 -> ECL  이 순서로 진행하는데... 순서 상의 문제는 일반적이다고 생각하는데, 특별한 문제가 있는지도 봐주시면 감사하겠습니다.   3) 사수에게 배운 결과, TBST에 보통 항체를 희석하는데... 사수에게 들은 얘기로는 skim milk에 항체를 희석하면 오래 보관이 힘들고 썪는다하여 TBST에 희석하라고 배웠습니다.  그렇다면, skim milk, BSA 다 보유 중이긴 한데... 희석해 써본 경험이 거의 없습니다. 보통 1차 항체가 최소 양(20 ul 내외)로 주문하다보니 모험을 할 수가 없더군요...ㅠㅠ 보통 TBST에 1:1000으로 희석해 overnight 사용 후 다시 얼려 보관하는 식이긴한데... 항체 보관 및 사용에 대해 문제점이 혹시 있는지도 조언 부탁드립니다.   우선 긴 질문들을 읽어주셔서 감사하고,    잘하고 싶은데 매 순간이 도전이고 고비여서 너무 힘드네요 ㅠㅠ   자세한 조언은 저에게 큰 힘이 됩니다.   답변 부탁드립니다. 선배님들  
회원작성글 kodo2001  |  2022.11.16
Q. SDS-PAGE 조건
1. BSA와 트롬빈을 SDS-PAGE로 내릴건데, 각각 buffer를 뭐를 사용해야하는지 알 수 있을까요? 2. 각 sample을 BCA assay를 이용해서 단백질 함량을 구한 후 단백질 양이 50ug이 되도록 로딩해야할까요? 3. gel %는 10-14%면 적당할까요? 4. 둘이 한 gel에서 내리려면 유의할 사항이 있을까요? 5. 참고가 될 만한 논문이 있다면 첨부해주시면 큰 도움이 됩니다.
회원작성글 korealab  |  2022.11.15
Q. Western blot 밴드 정량 및 계산
안녕하세요. Western blot 실험결과 정리 중 궁금한것이 있어 질문드립니다.   Western blot 후 단백질 발현양을 계산 할 때, ImageJ 를 사용하여 밴드 intensity를 측정하고, 이를 β-actin intensity로 보정하여 상대적인 발현양으로 정리하였습니다. 특정 단백질의 발현양을 계산하는 것은 크게 문제가 없었는데, 단백질 A와 B의 비율계산을 할 때 혼란이 와서 질문 남깁니다.   한번의 loading에서 단백질A, B, β-actin을 확인하면 A와 B의 band intensity는 같은 값의 β-actin intensity로 normalization 될 것이고, 결국에 A와 B의 비율로 계산을 하면 보정값이 상쇄(?) 되는 것이니 β-actin normalization 값이 무의미하다고 봐도 될까요? (이게 맞다면 β-actin의 경우 각 그룹별로 동일한 양으로 loading 되었음을 band 이미지로 보여주기만 하고, 정량값 계산에는 사용되지 않는다고 보면 될까요?) 아니면 A와 B의 ratio를 β-actin intensity로 보정을 하는것이 맞는지.. 그것도 아니라면 A와 B를 따로 loading 하여 각각의 loading control (β-actin) 값을 가지고 계산하는 것이 맞을지..   연구원님들께서는 어떻게 결과 정리를 하시는지 조언 부탁드리고자 합니다!
회원작성글 글씨야  |  2022.11.15
Q. 시그마사의 안티바디를 사서 사용해 보신분들,, 도움 좀 얻고자합니다!
우선 제 웨스턴 프로토콜은 다음과 같습니다. 로딩  step1. 50v 400mA, 70min Step2. 100v 400mA 120min 트렌스퍼 버퍼 조성 dw700, 메탄올100, 1x버퍼 200 멤브레인 NC 스티로폼에 아이스 가득 넣고, 아이스 팩 넣음 80v 400mA 120min 수행 폰슈로 단백질 확인 후 워시 10min*3 블락킹 skim milk 5% 실온 두시간 1AB  스킴밀크 5% 1:1000  4C 쉐이킹하며 O/N 16시간 워시 10min*3 2AB 실온 1:4000 1시간   워시 10min*3 디텍팅 ----------------- 이번에 시그마사의 제품을 처음 구입해서 웨스턴을 수행했더니 단백질이 다 달라붙어서 디텍이 안되고 시커멓게만 뜹니다,,   문제는 배송 올때 데이터 시트 조차 같이 동봉되어있지 않아,, 홈페이지에서 찾았는데 그마저도 자세하지 않네요,,   제가 알고 있는 프로토콜과 다른건지 웨스턴을 했더니 전혀 반응이 없어요. 데이터 시트 첨부합니다. 분명 반응 종에 마우스와 인간 이라고 되어있고, 제 실험은 마우스 입니다,,    데이터 시트엔 이렇게 나와있어요.  Western Blotting Analysis: Representative lot data. Human lung tissue lysate was probed with Cat. No. AB3420-I, Anti-Surfactant Protein A (0.5 µg/mL).  Proteins were visualized using a Donkey Anti-Rabbit IgG secondary antibody conjugated to HRP and a chemiluminescence detection system. Arrow indicates Surfactant Protein A (~35 kDa) Western Blotting Analysis: 0.5 µg/mL of this antibody detected Surfactant Protein A in 10 µg of human lung tissue lysate. 웨스턴 블로팅 분석: 0.5µg/mL의 이 항체는 10µg의 인간 폐 조직 용해물에서 계면활성제 단백질 A를 검출했습니다.   라그렇다면 스킴밀크 혹은 BSA 1ml당 0.5ug의 안티바디를 첨가해야한다는걸까요,, 10ml의 안티바디를 만든다면 5ug가 들어가야한다는 말이 맞는지요?
회원작성글 진vv  |  2022.11.14
Q. 안녕하세요 진짜 정말 너무 감사합니다.. 진짜!!
한 이틀동안 질문 올리며 1차 bsa와 섞는 문제로 골머리 앓았던 사람이에요. 여기 계신선생님들 덕분에 처음으로 밴드 시그널을 봤습니다,, 샘플 버린다 생각하고 여기 선생님들 알려주신대오 시험삼아 웨스턴을 한거라 밴드가 예쁘지 않고 끌려내려온 흔적이 있지만,, 아무튼 진짜 처음으로 이런 밴드라도 봤어요,, 덕분입니다. Bsa를 주문한 것이 아직 도착하지 않아서 실험실에 남아있던 10년도 넘어보이는 bsa를 희석해서 사용해서 이상한건지 알 수는 없지만,, 아무튼 진짜 너무 감사드려요!!!!정말 너무 감사합니다ㅠㅠ     그리고,,조금 불안해서,, 혹시 5% bsa로 1차를 붙일때 주의해야하는 사항이 있나요? 블락킹을 아주 오래 하는 것이 좋다던지 2차를 오래 씻어내는 것이 좋다던지요..   저 웨스턴의 경우 블락킹을 5퍼 스킴밀크로 1시간 1차 1:1000 tbst in 5% bsa 16시간 워시 10분*3 2차 1:4000 skim milk 5% 1시간 워시 10분*5   수행하였습니다.
회원작성글 진vv  |  2022.11.11
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