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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
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Q. ChIP assay 질문이요
논문에 ChIP assay결과가 나오는데,input이라고 되어있는게 뭐죠?cell에 뭘 주었다는 거죠?methods에도 안나와 있네요
초보  |  2013.05.31
Q. chromatin immunoprecipitation에 대해 한번 더 질문할게요
여기서  input부분에서 FGF2 를 주었을 때 (+)가 안주었을 때(-) 보다 밴드게 흐리게 나왔는데이것의 의미를 알고 싶습니다.  FGF2 를 주었을 때 PAX3 부분 중 일부가 발현이 더 되는것이라면 오히려 밴드가 더 두껍게 나와야 하는것 아닌가요? 어째서 FGF2의 처리가 없었을 때(-)가 밴드가 다 발현이 된 것일까요?
대학원생  |  2013.05.21
Q. chromatin immunoprecipitation에 관한 질문입니다.
ChIP analysis revealed that SBEs near the trnascription start stie of PAX3 promoter were amplified from crosslinked chromatin isolated from FGF2-treated human primay melanocytes and immunoprecipitated with specific anti-STAT3 antibody, but not from multiple controls.이렇게설명이 되어있는데 여기 figure에서 no antibody, anti-stst3, input이 뜻하는게 무엇인지 알 수 있을까요...?
대학원생  |  2013.05.20
Q. IP를 처음 시작하는 학생입니다~
이번에 IP를 처음 시작하는 학생입니다. 이것저것 공부하고 있긴 한데, 궁금한 점이 많아서 이렇게 질문올립니다! 1. IP용 항체단백질까지 다 뽑아놓고 보니, IP용 항체가 따로 있다는걸 깨달았습니다..확인해보니 IP용이 아닌 항체도 있더라구요.. IP용 항체는 다른 항체들과 뭐가 다른가요..?그리고, bead와 binding 할 항체는 IP용이더라도,나중에 eluted protein과 interaction 하고있는 다른 단백질을 WB 를 통해서 알아보고자 할때는 그냥 WB용 항체를 사용해도 되는건가요..? 2. 단백질 농도이 문제는 프로토콜 상에도 나와있지 않아서요..검색해보니 잘 나오는 것은 적은 양으로도 가능하지만 안되는것은 아무리 높혀도 안된다고 하던데요.. 보통 어느 정도로 시작해야 할까요?참고로 저는 magnetic bead-protein G를 사용하려고 합니다. magnetic은 agarose나 sepharose 보다 손실이 적을 것 같은데, 그럼 더 적은 양을 사용해도 되는건지요.. 3. grouping일단 제가 생각한 group은 1) 조직에서 추출한 단백질 원액 2) bead-Ab-Antigen 까지 결합시키고 제거한 상층액 3) 최종 elution 한 단백질 이렇게 입니다.. 이렇게 하면 yield 정도는 알 수 있지 않을까 해서요..다른 그룹이 더 필요한가요..? 처음에 bead와 항체를 붙일 때 target protein 대신 같은 종의 (rabbit or mouse) serum을 넣어서 positive control (?) 도 추가해야 하는건가요..? 처음이라 궁금한것이 너무 많습니다 ㅠ 주위에 조언을 구할데도 없구요..이것저것 좋은 조언 부탁드립니다~
초보자  |  2013.05.13
Q. 단백질정량
안녕하세요.오늘 CO-IP를 배우는데 단백질을 추출해서 단백질정량을. 하려고Spectrophotometer를 이용하는데. 1X Protein assay sol 1ml에 샘플 2ul를 섞어서Bradford 메뉴로 측정할때 희석배수는 몇으로 하나요?시범보이시는. 분이. 첨에 희석배수를 2로 눌러서. 측정한후. 0.5인데 실수하셨다며나온값을 다 4로 나누어서 쓰시더라구요..이해가 안되서요..희석배율을 50으로. 해야하지. 않나요?
Coip  |  2013.03.05
Q. ubiquitin관련 실험 질문입니다.
HEK293FT cell에 HA-Ub 만 넣어 transfection 한 걸 control로 잡고 있는데요 target protein을 IP해서 IB로 HA 붙여 봤는데 꼭 ubiquitin된 거처럼 나와요, 나오면 안되는데 왜 나오는지 실험 방법문제가 잘못된건지...아시는지요..
혜죽혜죽  |  2013.02.22
Q. pre b cell line 구합니다..
38b9 pre b cell line을 구하고 있습니다..저희 나라에서 이 cell line을 구할 수 있을까요??만약 가지고 계신분이 있으시다면bobal@naver.com으로 연락 부탁드림니다.
아나바다  |  2013.02.01
Q. IgY precipitation
저는 IgY 침전을 실험하고 있는 학생입니다.먼저 계란을 깨서 노른자를 걸러내어 원심분리를 시킨 후, 상등액을 거릅니다.이 이후부터가 문제인데요. P.E.G 침전법을 써봤는데, 딱히 다른 반응이 없었습니다. 그나마 황산암모늄 용액을 넣고 섞으니 젤리(?)처럼 생기더군요.근데 그게 IgY인지도 확신이 가질 않습니다. 혹시나 해서 인터넷에서 난황단백질의 종류를 찾아봤는데 잘 나오지 않더군요.황산암모늄 용액은 40 wt%를 썼습니다. 마지막에는 젤리같은 것을 원심분리해서 하얀 침전물을 조금 얻었는데요....원심분리 이후 모든 과정에서 확신이 없습니다.그리고 40% 황산암모늄 용액을 만드는 것도 장난이 아니더군요. 분말들이 다 녹질 않아서 고생했습니다. 온돈를 높여가면서 섞어야할지... 잘 모르겠습니다.많은 도움 부탁드립니다.
회원작성글 sloth  |  2013.01.03
Q. ChIP 질문있습니다!! 꼭 좀 답변해주세요 ㅜㅜ
ChIP 실험중에 있습니다처음 DNA shearing을 확인하기 위해 10^6의 cell을 가지고 모두 sonication 후 reverse cross link 하였고, 그 중 1%를 취하여 특정 gene PCR을 했을때 밴드가 깔끔하게 잘 나왔었습니다.그 후 sonication 조건을 유지하고 ChIP을 진행하였는데, 10^6의 cell을 sonication한 후 10% 양만 따로 -20도에 보관했다가 나중에 reverse cross link를 IP한 sample과 같이 했습니다.이 과정에서 DNA 양이 적을 거라 생각은 했지만 에탄올 침전 후에 바닥에 아무것도 보이지 않더군요.PCR을 한후 gel에 로딩하였으나 input 부분에서 아무런 밴드가 나오지 않았습니다.antibody반응을 하지 않은 negative control과 IP sample에서는 밴드가 나왔는데 negative control에는 non-specific band가 강하게 잡힙니다. IP sample에서는 나와야 하는 gene 위치에서부터 (150bp) 밑에 non-specific band으로 추정되는 부분까지 연결되서 smear한 양상을 보이네요.1. cell의 양을 어느 정도로 늘려야 할지 궁금합니다2. input에서 아무것도 나오지 않은 이유가 무엇일까요 ㅠㅠ3. non-specific band를 없앨 수 있는 방법이 있을까요4. smear한 band 형태를 보이는 것은 왜일까요, sonication의 문제라고 봐지는데 맞는지 알려주세요
대학원  |  2012.11.09
Q. PAR-CLIP 해보신분께 질문 드립니다(crosslinking
제가 suspension cell을 이용하여  PAR-CLIP을 하고 있습니다실험중에서 crosslinking의 실험방법이,1) 2x10^7 cell harvest하여 800g 4℃ 5분 centrifuge2) 상층액 제거 후에 PBS 20ml 넣고 washing 하여 800g 4℃ 5분 centrifuge3) 상층액 제거 후에 PBS 20ml 넣고 15cm cell culture plate에 고르게 핌4) ice 위에 plate 올려놓고 UV crosslinker 200mJ/cm^2 노출 시킴5) tube로 옮긴 후에 800g 4℃ 5분 centrifuge 5)번 과정까지 하면, 3)번 과정까지 보이던 pellet들이 보이질 않습니다원래 loss가 심한건가요? 아니면 제 실험 방법에 문제가 있는건가요?
회원작성글 식당  |  2012.10.31
Q. RNA-PROTEIN UV CROSS-LINKING 질문입니다
제가 RNA와 단백질의 결합을 확인하려고 UV cross-linking을 한 후에 IP를 실시하려하는데요,웹검색으로 해본 결과 labeling을 해서 cross-linking하는 방법만 나오네요 계속 ㅠㅠ혹시 주제 상관없이 rna와 단백질에 대한 cross-linking을 했던 논문이나 정보들 아시는거 있으시면 알려주실 수 있으신가요?
늅늅  |  2012.10.17
Q. 간독성을 알아보려고합니다.
마우스에 thioacetamide를 투여하여 간독성을 알아보려고합니다.invivo실험은 디자인을 잡았는데, in vitro에서 간독성에 관련된면역작용같은것을 알아볼방법이있나요?사이토카인에관련된....
실험자  |  2012.09.20
Q. IP를 하루만에 끝낼려고 합니다
제가 기존에 하던 IP방법은cell lysate에 antibody를 4℃에서 overnight 한 후에다시 4℃에서 1시간 bead 처리를 해서 취하는 방식이였습니다.원하던 band는 선명하게 나왔었구요..동일한 antibody를 이용하여 하루만에 끝내보려 하는데요,antibody를 상온에서 4시간정도 처리한 후에 4℃에서 bead 1시간정도 하는 방법으로 진행하면괜찮을련지 알고 싶습니다.
IP초보  |  2012.09.03
Q. immunoprecipiation 항체 준비 기본적인 질문 드려요
immunoprecipiation을 처음 하는 사람입니다.항체 준비를 하려고 하는데요IP 할때 mono를 쓰던 poly를 쓰던 차이가 있나요?혹, mono를 쓰는게 더 좋은건지..아닌지 모르겠네요..설명 부탁드립니다.참고로 항체는 구했으며, application IP 가능인 항체입니다.
회원작성글 celling  |  2012.08.17
Q. IP 관련 문의입니당~
제가 IP를 하기위해서 하루전에 antibody + protein A/G + PBS를 넣고 overnight을 해 뒀습니다. 그런데 IP를 하기에는 cell 수가 좀 적어서요;;;다시 cell을 키운담에 IP를 해얄것 같은뎅전처리해둔 antibody와 protein A/G mixture를 장기간 둬도 상관없는 건가요??그냥 냉장에 보관하면 될까요??소중한 답변 부탁드립니당ㅠ
회원작성글 anga  |  2012.07.03
Q. IP 실험에서 문제
저번에 글을 올렸는데 답변을 받았긴 했지만 의미를 잘 이해를 못해서 다시 올립니다.현재 IP 실험을 진행중인데.... 아주 원초적인 문제에 직면하고 있는중입니다.target protein은 명명상 LEE 라 하겠습니다.bead는 산타 A/G complex bead를 사용했습니다.flag이 결합된 단백질을 transfection를 한후 IP-flag(마우스)으로 땡겼습니다.그다음 IB-LEE했습니다.(rabbit) 세컨 안티바디는 셀시그날 안티바디를 사용했습니다.위 조건대로라면 heavy chain 부분이 안잡혀야 맞는데 자꾸 시그날이 뜹니다.이게 bead의 non 바인딩인지 아님 세컨이 다른종을 인식하는지 알고 싶습니다.또한 protein A-HRP 세컨도 써봤지만 또같이 heavy chain부분에 시그날이 나타납니다.pre-cleaning 다 한상태고.....  propadrum님께서 답글 잘 받았습니다. 이대로 한번 진행을해볼 예정인데.... 혹시 이런 경험 해보시고 해결해 보신분 있으시면 자세한 protocol좀..보내주시면.... 안될까요? 메인 실험이IP인데 이것때문에 아주 클로닝을 신나게 하고 있습니다.GFP 벡터로다가 옮겨서 사이즈 키우고 있는중............ 제발..
회원작성글 스마일어게인  |  2012.06.01
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