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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunocytochemistry
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Q. cryosection과 paraffinsection의 차이
cryosection과 paraffinsection의 다른점이 궁금합니다.
이공학도  |  2016.05.19
Q. 4% paraformaldehyde 의 fixation 원리
fixing agent인 4% paraformaldehyde가 fixation 원리에 대해서 알고 싶습니다.
이공학도  |  2016.05.19
Q. IHC에서 paraffin block 만들때 질문입니다.
IHC전 paraffin block을 만드는 중입니다.다름이아니라70 EtOH in DEPC 에서 o/n 후70% EtOH 1시간반/1시간95%      1시간반 / 1시간100%     1시간반 / 1시간자일렌    1시간반/1시간paraffin 1,2 각 2시간 하고 굳힙니다.하루에 하기엔 너무 긴시간을 필요로하여 중간에 o/n할수 있는 단계 혹은 단축방법이 있나요
나인투식스  |  2016.05.17
Q. IHC 1차 antibody 질문좀 드릴게요
IHC할때 antibody 비율이 꽤 높은 편이자나요 혹시IHC 1차 antibody 재사용 할수 있는지 알려주시면 감사하겠습니다.
아껴야..  |  2016.05.12
Q. 조직을 절편낼때 방법의 차이?
안녕하세요.심장조직을 얻어서 masson's trichrome 또는 GFP를 보려고 합니다.조직을 formalin에 고정 후, paraffin 으로 block만들어서 섹션하려고 하는데요,OCT방법에서는 절편제작시 형태보존을 위해서 30%sucrose에 가라앉을 때까지 나뒀다가 했는데파라핀을 이용한 방법을 할때도 sucrose를 이용한 경도유지(?)를 해야 할까요?어리석은 질문같지만 고수님들의 많은 조언 부탁드립니다.
scoco  |  2016.05.06
Q. trichrome stain 질문좀 드릴게요.
폐조직 radiation을 주고 fibrosis를 관찰하기 위해 trichrome stain을 하고 있는데요. 모든 과정 종료후 mounting을 하였는데 여기서 문제가 발생했습니다.dehyrate 까지는 별 이상 없었는데 mounting 후 조금 지난후에 보니mounting액 사이로 붉게 염색된부분이 밖으로 빠져 나옵니다.(그리고 scaning 하니 붉은 염색이 빠져나온 부분들은 온통 파란색으로 염색되어있구요..)mounting 하자마자 봤을때는 잘 염색된걸로 보였습니다.mount 액이 문제인걸까요? 수용성mount 라고 되어있구요.immunobioscience Corp. 제품 organo(Limonene) mount 를 사용하였습니다.trichrome 고수님 도움요청드려요
trichrome  |  2016.04.18
Q. bric분들은 IHC중 tissue embedding이나 xylene 처리 후 mounting 어떻게하시나요?
저희 실험실에서IHC를 frozen으로 cryocut 후이를 반응시켜서 slide에 embedding 후 탈수시킬건 탈수시키고 xylene담글건 담그고..해서 mounting을 하는데요..저희 교수님 방에서 아얘 처음으로 vivo실험하는데그래서 옆팀 박사님들께 교육받는데이건 좀 전적으로 제가 연습해야할 부분이긴한데요..목디스크가 있어서 한번에 너무 많은 tissue를 다루기가 힘들다보니조금씩밖에 못해서 요령이 늘지를 못해서 다른 사람들은 어떻게 쓰시는지궁금해서요.저희는 tissue embedding할때, D.W에 tissue 다 풀어헤쳐서멀쩡한애들만 남겨놓고, 이때 다루는게 그냥 얇은 붓...0호 붓 제일 얇은 붓을 사용해서펼치는데.. slide는 silane coating된것을 사용합니다. 조직을 붙인다고는 붙이는데... 자꾸 쭈글쭈글해집니다..전에 조직실험하셨던 졸업자분들이시나 다른분들 보면어떻게 저게 저렇게 말끔하게 싸르르르ㅡ 펼쳐지지??라는 생각이 들정도로 너무나 쭈글쭈글해집니다.. cryocut할때 24well에 tissue 담그는데brain하나 자를 때 6~8well에 tissue 전부 다 담습니다.하나 자르고 1번 well 하나 자르고 2번 well ... 한줄 차면 다시1번 well로 돌아가서 tissue 담그고..이런식으로 합니다 tissue가 너무 많아서 그런건지일단 염색반응이나 항체붙일때도 많이 쭈글쭈글해지기도 하구요.. 말끔하게 펼쳤다? 싶으면 찢어지고물에서 꺼내면 다시 쭈글쭈글해지고.. 백번 맞는 말씀이지만다들 연습이 답이다.라고 하시고 별다른 팁이 없다하시니 미칠 노릇입니다.ㅠㅠ In vivo실험이 숙달되는데에 상당한 시간이 걸린다고는 하나..조바심이 나서 이런건지하.. 다른 선배님들이나 브릭 분들은 어떻게 펼치시는지 궁금합니다.그리고, DAB staining 후 , EtOH 70%~100%까지 10분마다 10%씩 올려서 탈수시키고나서xylene에 하루정도 담갔다가 mounting을 하는데, 현미경을 보면 시꺼멓게 mounting solution자국이 장난이 아닙니다.xylene 톡톡 털어내고 살짝 닦아낸다음에 permount solution 한방울 정도 떨구고cover glass로 덮습니다. 그리고 면봉으로 xylene을 적셔서 최대한 기포,먼지 빡빡 밀어서glass 안깨질만큼..빡빡 밀어서 다 제거하려고 노력하면서도 제거하고 말려둡니다.근데.  잘 안지워집니다...ㅠㅠ 다른 방법이 또 있는지 궁금합니다..거의 몇달내내 다른실험들이 많아서 IHC 얼마 못하기도 했지만너무 답답하여 글을 써봅니다.
회원작성글 통합2년차  |  2016.03.19
Q. IFN-β를 injection 했는데 lymphocyte activation이 떨어졌습니다. 왜 그렇죠?
비교 실험으로 lymphocyte(CD4+,CD8+ T cell)의 activation 정도를 확인할 필요가 있었습니다.그래서 IFN-β를 mice에 injection 하고 lymphocyte를 harvest한 후 CD69로 marking 해서 activation frequency를 확인했습니다. 결과 IFN-β의 injection양의 증가에 따라 activation frequency가 증가했는데 마지막에 와서 갑자기 훅 떨어지네요... 실험에 잘못 된 것이 있는건가요? 아니면 면역학적으로 본래 일어나는 현상인가요?IFN-β injection 양은 서로 다른 농도로 같은양을 주입했고 그 농도는 다음과 같습니다.0 / 200 / 500 / 1000 / 2000 [U/ml]그리고 CD69+ frequency는 FACS를 사용하였습니다.P.S 논문 자료에서 Error bar represents SEM 이라는 말이 있는데 SEM이 뭔가요? 그 현미경 SEM 말하는건가요?
회원작성글 스페이트  |  2016.02.05
Q. IHC mounting 질문드립니다.
안녕하세요 요즘 IHC공부하고 있는 대학원생 입니다.논문을 찾아보니, mounting 할 때 DAPI로 mounting하는 경우가 있고, 핵을 따로 stain하고 aquamounting으로 mounting하는 경우가 있던데, 두 가지 차이점은 무엇인가요?
대학원생  |  2016.02.03
Q. IHC-P 2차 antibody 질문입니다. ㅜㅜ 도와주세요
안녕하세요 ㅜㅜ  제가 너무 몰라서 글을 남기게 되었습니다.동물실험한 하다가 처음으로  IHC를 시작하게 되었는데요 정보를 검색해서 혼자 해볼려다가 제가 정확하게 알고 있는지 궁금하여 글을 남기게되었습니다. 지금  Rat tail disc에서 collagen을 확인하기 위한 실험입니다. 1차 antiboday로는 abcam : Anti-Collagen 2 antibody (ab185430) 과                            snata cruz : CoL2A1(SH-28887)을 사용하려고 합니다. 근데 2차가 너무 햇갈립니다. abcam 은 Description에 있는 anti- mouse-Ig G를 쓰는게 맞나요? species reactivity 중 가능한 anti로 쓰는 건가요 ....????또한 Santa cruz에서는 COL2A1 Antibody (H-300) is a rabbit polyclonal IgG provided at 200 µg/ml 이라고 나와 있는데 이건 항체를  rabbit에서 만들었다는 거죠?  그럼 밑에 나온 내용처럼 mouse, rat, human이면 된다는 걸까요?? (recommended for detection of Collagen α1 Type II, and to a lesser extent, Collagen α1 Type I of mouse, rat and human origin by WB, IP, IF IHC(P) and ELISA)아무것도 몰라서 그러는데요 꼭 좀 답변해주시면 감사하겠습니다.!!!!!!!http://www.abcam.com/collagen-ii-antibody-2b15-ab185430.htmlhttp://www.scbt.kr/datasheet-28887-col2a1-h-300-antibody.html
회원작성글 컁컁  |  2015.12.14
Q. Live cell immunocytochemistry 다들 어떻게 하시는지요?? 첨부파일
안녕하세요membrane protein 발현을 보기위해 ICC를 하고 있는 학생입니다. 워낙 발현이 잘 안되는 단백질이고, 멤브레인 발현 패턴(세포막에 dotted shape이라는 그 패턴...)을 확인하려고 live cell ICC를 수행하고있는데, 굉장히 어렵습니다..더군다나 최근 brightfield에서 사진과 같은 이상한 나뭇가지 같은걸 발견해서 당혹스럽습니다.혹시 이것이 무엇인지 아신다면 댓글 부탁드려요...또한, live cell ICC를 성공적으로 수행하고 계시는 선생님들의 도움이 필요합니다.. membrane protein을 보기 위해서는 permeabilization을 하지 않는 것이 크리티컬하다는 것을알지만, 결과는 잘 나오지 않습니다...거의 6개월 이상 이것과 씨름 중인데요.. 혹시 가능하시다면 다른 선생님들의 프로토콜을 제게 보내주실 수는 없는지요... 부탁드립니다 ㅠㅠㅠ
석사2학기...  |  2015.11.18
Q. ICC에서 DAPI가 흐리게 뿌옇게 나옵니다... 첨부파일
안녕하세요제가 지금 ICC를 진행중인데, 요즘 들어 자꾸 DAPI가 뚜렷하지 않고 뿌옇게 나와원인을 찾는 중에 도움을 요청드리고자 글을 쓰게 되었습니다.질문은 두가지 입니다.1. DAPI가 뿌옇게 보일때의 트러블 슈팅.DAPI가 포함된 mounting solution을 사용중이구요사진 첨부한 것 처럼 핵이 보이긴 보이지만, 초점이 잘 안잡혀 경계가 명확하지가 않고, 백그라운드도 높고, 화면이 전체적으로 뿌옇게 구름낀 것 처럼 보입니다..예전에는 정말 까만 배경에 동그란 핵만 파랗고 밝은 시그널만 보였는데 말이죠...이게 마운팅 과정 상 문제가 있었던 건지 어떤건지 잘 모르겠습니다..2. Live cell ICC 프로토콜.membrane protein을 보기 위해서 live cell ICC도 같이 하고 있습니다.저희 실험실 프로토콜은 다음과 같습니다.1. 우선 cell을 PDL과 Laminin 코팅을 한 coverslip에서 키우고요 (2.5x10^5 개 seeding) 2. parafilm을 깐 dish에 coverslip을 옮겨줍니다 (얼음위에서 진행) 3. PBS wash 4. Blocking : 10% Horse serum+1%BSA in PBS (30분 x2번)5. Primary Ab (1:50) 1시간6. PBS wash 10분x3번7. Secondary AB (1:100) 1시간8. PBS wash 10분 x3번9. Fix 4%PFA 15분10. PBS wash 11. mounting일반적인 ICC를 할 때는 fix와 permeabilization을 앞에 해준 다음 염색을 하지만Live cell ICC에서는 permeabiliation은 생략하고 fix를 염색을 다 한 후 마지막에 해주고 있습니다.그렇지만 다른 프로토콜들을 찾아보니, fix를 먼저 짧게 혹은 낮은 농도로 해주시는 경우도 있더라구요. 이렇게 fix를 나중에 하시는 분도 계신가요?? 또 일반적인 ICC는 1차 안티바디를 4도씨에서 overnight으로 반응시키는데이 Live cell ICC도 overnight으로 반응시키려면 fix를 먼저 해줘야 할 것 같은데요,fix를 하지 않은 채로 밤새 반응시키면 cell에 어떤 영향을 줄 수도 있을 것 같습니다.선배님들의 조언 부탁드립니다. 
석사  |  2015.11.11
Q. ICC나 ICH antibody incubation할 때 무조건 detergent를 넣어야 하나요?
washing buffer를 할 때는 detergent가 unspecific bond를 제거해준다고 했는데antibody(primary, secondary 모두) incubation을 할 때에 왜 쓰는지 잘 모르겠어요...unspecific bond를 없애주는 역할을 하기도 하는데...그럼 antibody가 붙는 것도 같이 씻겨 나가는거 아닌가요....?뭔가 잘 모르겠는데ㅠㅠ
회원작성글 DK51  |  2015.10.05
Q. 헤마톡신 시약 추천좀요..
헤마톡신 시약 추천 부탁드리겠습니다.제가 dako를 쓰고 있는데 너무 약해서요..특히 brain 해마 부분을 보는데요mayer로 추천드립니다.기왕이면 procotol도 써주시면.ㅠ.ㅠ 하는 방법은 아는데 비교를 할려구요.ㅠㅠ 그럼 답변 부탁드립니다.
초보  |  2015.10.02
Q. mouse ear skin histology 첨부파일
제가 마우스 실험은 초짜라 아토피 유발 마우스 ear 를 H&E staining을 했는데,뭐가 뭔지 잘 모르겠네요. 논문 참조해도 귀연골 정도만 확인가능하고나머지 1, 2, 3번은 피지선인지 셀인지 뭔지 구별이 힘듭니다.neutrophil, eosinophil 등도 볼 수 있는지?사진이 좀 안 나왔기는 한데 고수님 분들 확인해 주시고 답변 부탁드립니다.답변 주실 모든 분께 미리 감사드립니다.
오랫만에~  |  2015.09.01
Q. 사진좀 봐주세요.(병리학 고수님들 도와주세요) 첨부파일
안녕하세요mouse muscle 조직을 이용하여 CD8 염색을 진행하여 fast fed로 발색하였습니다.그런데 붉게 염색된 세포가 주로 어떤 세포들인지.. 구분하기가 ㅠㅠ
연구원..  |  2015.08.20
Q. ICC or IHC 잘하는 분들 있나요? 첨부파일
사진을 보시면 green fluorescence image 인데요....4% pfa로 5분동안 fix하고permeabilization이랑 블로킹을 하고NeuN으로 immunostaining을 한 사진입니다백그라운드가 너무 강합니다...니콘 형광현미경으로 찍는데여러 가지 메뉴를 사용해서 백그라운드를 조절할 수 있지만원채 백그라운드가 강해저 좀처럼 컨트롤을 할 수가 없습니다...이렇게 백그라운드가 많이 나오는 이유는 보통 어떤 것인가요?1st ab.인 neun는 상온에서 2시간 붙이고2nd ab.는 상온에서 2시간을 붙이고DAPI가 들어있는 mounting solution으로 처리해줍니다...혹시 저와 같은 경우에서 어떤 트러블슈팅을 해서결과가 좋아진 분이 있으면 조언을 듣고 싶습니다ㅠㅠ대체 무엇이 이유일까요?
회원작성글 DK51  |  2015.08.20
Q. crystal violet
plaque assay를 하기위해 0.2% crystal violet solution을 만들고 싶습니다.검색을 해보니 20% ethanol에 0.2% crystal violet을 만들라고 되어있습니다.protocol을 보니 먼저 absolute ethanol에 1% crystal violet을 만들고 이것을 1:5 dilution하는 것 같습니다. 제가 찾아본 것이 맞는지요그리고 왜 20% ethanol에 녹이는지 궁금합니다. 그냥 PBS에 녹이면 안되는 것인지요.filter를 해야 하는지 궁금합니다.
초보  |  2015.08.17
Q. Immunogold labeling 가능한곳 없나요?
국내에 Immunogold/TEM 해주는곳 없을까요?필요한데 대행서비스 해주는곳은 없는거 같고 어떻게 해야할지 모르겠네요.
김지혜  |  2015.07.07
Q. 웨스턴에서는 발현되고 ICC로는 안잡히는 이유가 뭘까요
실험을 하다가 이상한 현상때문에 진전을 못보이고 있는 대학원생입니다...한유전자에 myc을 붙였습니다. size는 약 1.9kb  이구요 클로닝을 해서 발현확인을 위해 웨스턴을 했고 myc을 붙여 확인이 된후,neuron cell에 넣고 ICC를 진행했는데.. 하나도 안보입니다 GFP랑 co-transfection을 해서 transfection 효율은 좋은데 보통 거의 co-transfection 하면 한셀에 같이 들어가는데 이건 눈씻고 봐도 없네요.하나가 있을까 말까??항체가 이상한가 싶어서 다른 myc이 붙은 유전자들이랑 HEKcell에서 발현시켜봤는데 그건다 염색이되더라고요.. 신기하게도다른것들은 신경세포에서 염색되는거 확인햇구요.. 같은일차항체..같은 이차항체..지금 문제가 신경세포에서만 있는것 같은데...머가 문제일까요........................ 양을 높여도 진전이 없는것 같아요도움주세요
궁금이  |  2015.06.18
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