colony 키워서 dna prep후 double digestion 1hr했습니다. 두개 엔자임중 1개가 working안한것일까요?1exp 2019년인데 사용 위에 두꺼운 밴드는 무엇일까요? 안잘린 것인지 pseudo colony인지요? 1kb size marker사용.

안녕하세요. 미생물전기화학시스템 전공자 박사과정생입니다. 흔히 환원전극으로 사용되는 Pt carbon 촉매에 바인더로 사용되는  Nafion™ perfluorinated resin solution 5 wt. % in lower aliphatic alcohols and water, contains 15-20% water 시약이 단종된 사실 알고 계시나요? ㅠㅠ 대체품을 찾으려는데 알아본 대체품도 성능이 탐탁치않습니다.  관련 실험 하시는 분들. 대체 바인더 시약 찾으신 분들. 정보 공유 주실 수 있나요? 

emb 배지에서  염료로 쓰이는 메틸렌블루와 이오신 염료 두 가지 모두 gram(+)를 inhibitor(억제)시킨다고 알고 있는데  어떤 원리로 억제시키는 건지 아는 분 있으면 설명부탁드립니다.

안녕하세요 세포실험이 초보인 학생입니다ㅜㅜ raw264.7 cell을 가지고 실험을 진행하고 있습니다. 펠렛에 5ml 배지를 풀어 카운팅을 진행하였고 28/4 * 10^4 * 5 = 3.5x10^5 이라는 결과가 나와습니다. 이상황에서 다시 원심분리후 배지 석션 후 새 배지를 풀었어야 하는데 그렇게 진행하지 않았네요ㅜㅜ 결국 5ml 현탁액을 이용해 100파이 디쉬에 에 3*10^5가 되도록 셀을 계대하고싶으면 1ml당으로 치면 28/4 x10^4=7x10^ 이렇게 되니 현탁액 4ml에 배지 8ml를 풀어서 토탈 12ml로 만들었어야 할까요? 세포를 웰에 푸는 카운팅보다 디쉬 계산이 더 어려운듯합니다ㅠㅠ.... 제가 한 계산이 맞는지 말해주실수있을까요ㅠㅠ  

유산균을 배양시킨 후 파우더로 제조하였습니다. 이때 유산균 파우더는 0.1g을 10mL 용액에 녹였고 해당 녹인 용액을 100 uL + saline 900 uL을 통해 희석했습니다. 5번째 희석한 것에서 100 uL을 도말했을 때 콜로니 수가 23개가 나왔다면 10 mL 용액에 녹인것도 희석한걸로 해석해서 23*(10^6)*10 CFU/mL 로 계산하는게 맞나요??

제가 현미경 10배율로 세포사진을 찍었는데 스케일바가 없어서 제가 직접 넣어햐하는 상황입니다.. 10배율로 세포사진을 찍었다면, 거리계산은 가능할 것 같은데 어떻게 계산을 해야할 지 모르겠습니다.. 저와 같은 상황이 있었던 분들의 도움을 얻고자 합니다  대략 생각하는 방법은 픽셀수로 거리계산이 가능할 것 같은데,,, 도저히 감이 안오네요.. 찾아봐도 정확한 방법은 없어서 이렇게 글을 씁니다 ppt, image j,그림판 등 여러 방법을 사용해서라도 꼭 넣어야하는 상황입니다 부탁드립니다

* 첨부파일을 올리려고하는데 1개만 가능하다는둥.. 업로드가 안되서 제가 그냥 글로 설명합니다;;. 답변해주신분들의 조언에 따라 cut 없이 gel 내려서 밴드확인했으며, 16일에 prep한 거 / 20일에 prep한 것 / 어제 colony 1개씩 따서 prep한 것 두개. 해서 총 네개로 테스트했습니다. 원래 사이즈는 5.5kb인데 5kb에 딱 걸친듯 살짝 밑 사이즈에 뜨는 것으로 봐서 super-coiled인가 싶어서 문제가 없다 생각을 했고 1ug으로 네가지 전부 다 NdeI 1ul, cutsmart buffer와 함께 먼저 2시간동안 잘랐습니다. 문제는 자르고 나니  오늘 prep한 애들은 ㅡ.ㅡ;;; 밴드가 사라졌습니다...;; 다만 16일과 20일에 prep한 애들은... 좀 smear하긴 하나 밴드가 linear 폼으로 잘려서 그런지 위와 다르게 5kb 살짝 위로 남아있어서 반응이 문제없이 된 것 같아서 현재 gel purification진행 중입니다. 도대체 때문에 이런 일이 발생하는걸까요 ㅡ.ㅡ;;  갑자기 저렇게 흔적도 없이 잘리려면 plasmid가 뭔가 문제가 있던가... 뭐든지 지금 DNase에 contamination됬다는 건데 혹시나 싶어서 새팁, 새 DW까지 썼는데..오염은 아닐것 같습니다.. 

시안산칼륨(KNCO)와 황산암모늄((NH4)2SO4)을 반응시켜 urea를 합성하는 실험에서 과정을 보면    1. 시안산칼륨 0.025mol을 증류수 10ml에 용해시킨다 2. 황산암모늄((NH4)2SO4) 0.02mol을 증류수 4.5ml에 용해시키고 1에서 만든 용액을 넣으면서 충분한 반응이 일어나도록 30분동안 섞는다. 3. K2SO4를 여과기로 제거한다. 4. 여과된 혼합액을 건조시킨다. 인데요   궁금한 점은 첫번째로 주어진 실험과정에서는 황산암모늄 용액에 시안산칼륨 용액을 넣어서 섞어주는데, 시안산칼륨 용액에 황산암모늄 용액을 넣어서 섞어주면 안되는 이유가 있나요? 두번째로 시안산칼륨은 증류수 10ml에 녹이고 황산암모늄은 증류수 4.5ml에 녹이는데 두 개의 증류수량이 왜 저렇게 설정되었는지 궁금합니다.

안녕하세요. 실험 시작한지 얼마되지 않은 석사생입니다. Cell 키우는 중에 comtam인지 아닌지 의심되는데 혼자 판단하기 어려워 질문 드립니다! 2일 전 > competent cell에 ampicilin 항생제 마커를 가진 plamid를 transformation시킨 후 cell을 LBA plate에 overnight 해서 1일 전 > 20mL 항생제 배지에 colony picking해서 넣고 overnight 시킨 후 오늘 > 300mL 배지(ampicilin 0)에 최종 O.D600가 0.01이 되도록 계산한 양만큼 cell을 접종해 7시간 정도 culture 진행했습니다.(culture condition 37도 230rpm) 원래 잘 자라지 않는 cell이라 지난 번에는 동일조건(시간,온도,rpm)으로 배양해도 OD값이 1.5가 안 되었는데 이번에는 2.5 가 넘었습니다. 구체적인 이유는 모르지만 Cell이 너무 잘 자라도 좋지 않다고 알고 있습니다. 특히 제 실험은 배양이 여기서 끝나는 게 아니라 단백질 생산 양을 늘리기 위해 연속적으로 180rpm 18도에서 overnight을 진행하고 있습니다.(induction은 진행하지 않습니다) 때문에 이게 단순히 cell이 많이 자란 것인지 contamination이 된 것인지 확인을 해봐야 될 것 같은데 저희 lab에는 안타깝게도 현미경이 없어서 혹시 확인할 수 있는 다른 방법이 있을지 조언을 구하고 싶습니다! 그런데 항생제를 넣어주면 contam 잘 일어나지 않는 것으로 알고 있는데 제가 잘못 알고 있는 걸까요..? 그리고 contamination 확인하려면 현미경으로 확인하는 게 맞는지 궁금합니다. transformation해서 키운 competent cell을 현미경으로 본 적이 없어서 생김새는 모르는 상태입니다. 저는 적어도 서로 다른 형태의 cell이 2가지 이상 있거나 하면 comtam이라고 판단할 수 있을 것 같아서 보는 게 맞다고 생각했습니다! Cell 구분이 어렵다면 검색으로 제 com cell 생김새라도 찾아서 비교해 보려구 했구요! 혹시 제 판단이 틀린 걸까요? 감사합니다!

안녕하세요? 환자 DNA의 변이를 haplotype에서 확인하고자, cloning 후 sequencing해서 보려고 합니다.   환자 혈액에서 분리한 RNA를 가지고, cDNA를 만들고, 그다음 gel extraction->cloning->sequencing 단계를 계획하고 있는데요.   환자전혈이 500ul 정도 될까말까하다보니  샘플을 다 써버릴까 걱정이 되어서 RNA를 아끼기위해 cDNA 를 사용하여 PCR를 한 다음 PCR product로 second PCR를 고민하고 있습니다. 제 실험 목표에 적용하여도 되는 실험방식일지 많은 의견 부탁드립니다.   지금 진행단계는 cDNA까지 합성하여서 sequecing으로 서열확인까지 하였습니다. 100ng cDNA로 PCR하고, gel에 2ul loading해보면 ACTB는 어~엄청 빵빵한데 cloning할 유전자는 밴드가 희미해서 second PCR을 고민하게 되었습니다.      

안녕하세요. 형광 단백질을 전달하는 AAV를 주문하려고하는데 표기법에 대한 이해가 부족해서요 예를들어, pAAV[Exp]-CBA>NLS_mCherry 라고 적혀있다고하면,   pAAV[Exp]는 AAV를 expression 하는 벡터이고 CBA는 상기 벡터에서 타겟 gene을 발현하는 프로모터일 것이고 >NLS_mCherry는 CBA 프로모터에 의해 발현되는 유전자로 이해하면 되는 것일까요? 해석이 맞을지 확인 부탁드립니다.   감사합니다.

S.pyogenes와 Group L 균을 사용해 bacitracin test를 했습니다. 저희 조는 S.pyogenes가 2.2cm, Group L이 1.8cm가 나왔는데 다른 조는 S.pyogenes가 2.5cm, Group L은 1.4cm가 나왔다고 합니다. 같은 균을 사용했는데도 왜 지름의 차이가 나는 걸까요? 접종할 때 간격이 문제였을까요?

Slide glass위에 aptes코팅을 해준뒤 metal 잡기 위해 edta를 코팅? 결합 하고싶은데 좋은 방법이 떠오르질 않아요.아시는 분 있나요?

pGEMT로 coling후 T7과 SP6로sequencing하려하는데 프로토콜을 봐도 몇pmol/ul농도로 시퀀싱하는지 안나와있어서..ㅠㅜ 농도 결정을 어떻게 하는건가요..?

안녕하세요. 항상 감사드립니다. 혼자 고군분투하고 있는 석사 수료생입니다.. luciferase assay를 수행해야 하는데,, 논문을 찾아가면서 필요한 material들을 정리해봤습니다.. 다음과 같이 실험하는 게 타당할지 검토해주시고 의견 주신다면 정말 큰 도움이 될 것 같습니다.   NF-κB가 특정 유전자 (gene X라고 하겠습니다) 의 프로모터에 결합해서 transcription을 조절한다는 가설로 실험을 진행하려고 합니다.   이를 위해 다음 세 종류의 플라스미드를 HEK293T cell에 transfection할 계획입니다. (1) geneX의 프로모터 (putative NF-κB binding site 포함)와 luciferase encoding region가 포함된 pGL3 basic vector → 직접 클로닝해서 얻을 예정   (2) NF-κB의 subunit 중 하나인 'p50'을 과발현시키기 위한 p50 expression vector → addgene에서 판매하는 'p50 cFlag pcDNA3' 구매 예정 → https://www.addgene.org/20018/   (3) NF-κB의 또 다른 subunit인 'RelA'를 과발현시키기 위한 RelA expression vector  → addgene에서 판매하는 'RelA cFlag pcDNA3' 구매 예정 → https://www.addgene.org/20012/   대조군을 위해 (1) 대신 putative NF-κB binding motif에 mutation을 도입한 vector도 제작할 예정입니다.   Transfection은 lipofectamine2000을 사용해서 3종류의 plasmid를 동시에 transfection할 계획입니다.   저의 디자인과 수행 방식이 타당한가요?   연구실에 자세히 물어볼 선배가 없어서 도움이 절실합니다.. Flag로 tag된 p50, RelA를 발현하는 벡터를 luciferase assay에서 해당 protein들의 과발현용으로 사용하는 것이 적절한지 확신이 서지 않습니다.. DNA binding effect에 영향을 주진 않을지.. 또 p50과 RelA는 heterodimer를 이루어서 작용하는데, flag가 둘의 결합에는 영향을 주지 않는지.. HEK293T monolayer에 세 종류의 plasmid를 동시에 transfection할 때 각각의 세포 안에 세 종류의 plasmid가 전부 들어가야 하는 건데.. 이걸 어떻게 확신할 수 있는지.. 실험에 대한 확신이 부족합니다..   고견 나누어주시면 반영해서 실험 잘 해보겠습니다. 미리 감사드립니다!!

안녕하세요 선배님들, 식품미생물학관련 실험실에서 석사과정을 지내고 있는 학생입니다. 제가 현재 phage DNA를 NCBI blastn를 돌려보고 있고 결과 중 query cover 결과에 대해 궁금한 점이 있어 질문을 남겨봅니다 제가 알기로는 query cover 혹은 coverage가 'query 중 결과와 align 된 query 길이의 비율'로 알고 있고 검색을 해봐도 저렇게 나왔습니다 만약 그렇다면  약 47Kbp짜리 query를 blastn을 돌려 결과의 query cover가 100%가 나오면 47Kbp가 모두 align되어야 맞는거 아닌가요? 그런데 query cover 100%/ percent identity 99%이상 나온 결과의  alignment 결과를 보니 37Kbp만 align되어 이상하다고 생각이 되어 질문을 남겨봅니다.ㅠ 감사합니다 선배님들  

안녕하세요! 이제 막 세포를 키우기 시작한 초보입니다. 실험 장비들도 거의 처음 사용하는데 그 중 현미경과 관련해서 질문드려요. 이번에 새로 구입한 현미경이 있는데 사용후 광원을 끄는 것을 잊고 세시간쯤 후 사용하려고 켜보니 일시적으로 광원이 작동하지 않았습니다. 광원을 꺼두어야 오래 사용할 수 있다는 것은 아는데 이렇게 즉각적으로 안켜지게 되나요? 혹은 제품의 하자를 의심해봐야하는 걸까요?

현재 cytotoxic CD8+T cell line을 구하고자 합니다. organism은 human으로 되도록 찾고자 하는데 primary도 어려울것 같고, atcc나 세포주은행에서 거의 list에 존재하지 않는것으로 보입니다.. 혹시 해당 cell line아시는 것 있으면 이름이라도 알려주시면 감사하겠습니다. 아니면 다르게 찾아볼 방법이라도.. 알려주시면 감사하겠습니다.

안녕하세요. 장비선택관련 질문이 있습니다. IF나 FISH같이 현미경을 통해 형광을 봐야되는 실험들에 있어서  각 실험들에 대한 현미경의 resolution 기준점이 있는건가요?? 논문들을 읽다보면 다 장비가 다르고 사용하는 소프트웨어도 다른데  이를 통용되는 기준이 있는 것인지  혹은 장비에 맞춰서 실험에 나오는 결과값을 조정하는 것인지 알고싶습니다.

안녕하세요, 질량분석기를 활용하여 C60의 질량을 측정을 할 때 파생되는 질문에 대한 해결법을 여쭙고자 합니다.   C12 원자의 질량은 12, 자연 존재비는 98.9%, C13 원자의 질량은 13, 자연 존재비는 1.1% 라고 가정하겠습니다.   C12 원자만으로 구성된 C60 풀러렌의 분자량은 720 으로, 720 분자량의 C60 분자가 질량분석기의 결과값에서 보여주는 피크의 상대값을 1이라고 가정합니다.   그러면, C12 원자 1개가 C13 원자 1개로 교체되어 분자량이 721인 C60 풀러렌의 피크의 상대값과, C12 원자 2개가 C13 원자 2개로 교체되어 분자량이 722인 C60 풀러렌의 피크의 상대값의 계산 과정과 원리가 궁금합니다.   고견 부탁드리겠습니다.