안녕하세요 단백질 발현시키는 과정에있습니다. OD값잴때 큐벳에 LB넣어주는이유? 찾아보니까 blank값 넣어주라는데 굳이넣어주는이유가 뭔가욥 ㅠㅠㅠ 

OD값이 높으면 세포 수가 많아져 빛을 튕겨내어 농도가 높다는건 알겠는데, 세포 수가 많은게 나쁜것인가 라는 의문이 생겨 질문드립니다!

PCR을 돌리고나서 증폭된 Band를 Gel extraction kit를 사용해서 DNA를 추출하고 있습니다. Gel을 자르고, 잘라낸 gel과 binding buffer를 1:1 비율로 섞어주고 heating block에서 약 10~15분정도 녹여준 뒤에, gel extraction kit의 protocol을 따라가면서 진행을 하고 있습니다. Gel extraction을 하고나서 nanodrop으로 DNA를 측정해보면, 260:280 값은 1.8 ~ 1.9 정도의 값이 꾸준하게 나오는데, 자꾸만 260:230값이 0.1 ~ 1.2 로 전체적으로 값이 낮고 변동이 큽니다. 해당 지표는 주로 buffer를 덜말려주는 것이 원인이라하여 washing buffer, elution buffer를 사용한 뒤 dry 시간도 충분히 늘려주고 했는데도 결과는 계속 이렇습니다 ㅠㅠ  혹시 해당 문제에 대한 원인을 아시거나, 제가 놓치고 있는 Gel extraction시 주의해야할 사항이 있을까요...?!  그리고 혹시 kit 에 포함된 elution buffer 대신에 nuclease free water를 사용하는게 더 나을까요??(사용해도 되는건지 잘 모릅니다만..)

24개 샘플을 mini prep 으로 DNA 를 뽑을라하니 거의 3시간이 걸리더군요 물론 좀 빠르게 할려고 S1 buffer를 많이 넣어 spin column이 넘치게 되면서 한번 다시 돌리면서 시간이 늘어났긴 했지만 이게 flow-through 를 제거하는 시간이 의외로 많이 걸리네요.. 혹시 mini prep kit 중에 시간을 많이 단축가능한 것이 있는지 알려주실수 있는지요? (현재는 코스모진텍 labor pass 사용중입니다.)    

이번에 마이크로 바이옴 분석 연구 진행하면서 토양 DNA를 추출해야하는데 저희 대학원생 선배는 아마 안해도 될 것 같다고 말을 하더라구요. 메뉴얼에도 멸균환경에서 진행하라는 말도 없고... 보통 멸균환경에서 진행하나요 아니면 별 차이 없다고 판단하고 밖에서 그냥 진행하나요??

안녕하세요 학교에서 구강상피세포 dna 추출 실험을 진행하게 된 고등학생입니다. 전문적인 지식 없이 인터넷의 다양한 사이트에서 정보를 조합해서 저희 학교에서 실험을 진행할 수 있게끔 정제하다 보니 올바른 실험 과정인지, 생략된 과정은 없는지 검토를 받고 싶습니다.      실험 과정입니다. ⑴ 컵에 생리식염수 1mL를 담고 조와 실험 조원 이름을 기재한다. ⑵ 45초 동안 입을 강하게 헹궈준다. (이때 더 많은 세포를 얻기 위해 뺨 안쪽을 살짝 씹어준다. - 피가 나지 않게 주의) 끝난 후 다시 컵에 뱉는다. ⑶ 피펫1을 이용하여 입을 헹군 식염수를 멸균처리된 뚜껑이 있는 튜브로 옮긴다. ⑷ 식염수가 담긴 튜브에 1mL의 Lysis buffer를 넣는다. ⑸ 피펫2을 이용하여 Proteinase K(단백질 분해효소)를 5방울 정도 넣고 뚜껑을 닫고 튜브를 잘 섞어준다. (Vortex Mixer 사용) ⑹ 잘 섞어 준 튜브를 56℃에서 10분 동안 배양해준다. ⑺ 배양된 튜브를 실온에 5분 정도 둔다. ⑻ 튜브를 45도 정도 각도로 잡고 피펫3을 이용하여 튜브 측면에 차가운 에탄올을 1mL 흘려준다. ⑼ 튜브랙에 꽂아둔 뒤 실온에 5분 정도 둔다. ⑽ 튜브 안의 용액의 표면에서 DNA가 보이는지 확인한다. 일부 DNA는 짙은 회색으로 보이거나 거품이 생길 수도 있다. ⑾ DNA가 들어 있는 튜브에 스포이드를 이용해 Flash blue™ solution 1방울 정도 넣어 DNA를 염색한다.     많은 조언과 지적 부탁드립니다.

제가 정신을 놓고 있다가... plasmid를 E.coli transformation하고, plasmid를 추출해야하는데, choromosomal dna isolation을 해버렸는데 이 dna에서 plamid를 정제하는 방법이 있을까요? 혹시나 해서 첨언하자면 저희 랩에서는 plasmid 추출은 kit를 사용합니다. choromosomal dna isolation protocol은 하기에 적혀있는대로 시행했습니다.. 도움 주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠ 14ml round-bottom tube에 YPD media를 3ml 넣고 single colony를 o/n culture. EP tube에 1을 1.5ml 따서 넣고 13000rpm 10min centrifuge 후 supernatant(sup) 제거. 50ul STES buffer와 50ul acid washed 0.4mm glass beads를 넣어준다. * Tip을 이용해서 glass beads가 cell pellet보다 아래로 내려갈 수 있도록 섞어줌 * STES : 0.5M NaCl, 0.2M Tris-HCl (pH 7.5), 0.01M EDTA, 1% SDS Vortexing 5min with multiple microtube mixer (TOMY). Add 200ul TE (pH8.0) Add 200ul phenol/chloroform/isoamyl alcohol (pH8.0) Vortexing 2min with TOMY. Centrifuge 13000rpm 10 min 후 sup (TE층 170~180ul)을 새 EP tube로 옮김. * 하층액이나 흰색 막이 섞여 들어가지 않도록 주의 -> PCR 효율을 저해할 수 있음 Add 17 ~ 18ul(0.1X volume of 8) 3M Sodium Acetate Add 500ul 100% EtOH (2~3X volume of 8), and -20℃ 30min incubation Centrifuge 13000rpm 10 min, discard the sup. Add 1ml 70% EtOH and vortexing (RT, 10min) Centrifuge 13000rpm 10 min, discard the sup. Dry in an oven for 20 min or RT 1hr 30min Dissolve it into 50ul~200ul 1X RW (restriction buffer containing 20ug/ml RNaseA)

콜로니 접종해서 미니프랩으로 dna 를 확인하기 전에 접종된 배지를 1ml 정도 stock 화 시켜두는데 문제는 미니프랩으로 dna 를 확인했을때 제가 원하지 않는 dna 일경우 해당 스탁을 모두 폐기해야합니다 이런 과정을 조금 최소화시키고자하는데 여러분들의 노하우가 있을지요?? 조언을 구합니다 그리고 스탁할때 글리세롤 20퍼정도 넣고있는데 이걸 넣을필요가 있는지 궁금한데 안넣어도 되는지 궁금합니다

안녕하세요 이번에 mouse primary cell에서 phenol/chloroform/isoamyl alcohol method로 처음 gDNA를 뽑아서 spectrophotometer와 gel electrophoresis로 gDNA가 잘 뽑혔는지 확인했습니다. 그리고 sample 일부는 RNaseA treatment (37℃, 2h)한 뒤 3M NaAc와 ethanol로 다시 precipitation시켜서 RnaseA 처리 전 gDNA sample과 함께 gel에 걸어서 확인했습니다. 사진은 gel electrophoresis의 결과인데, 1 2 3번 샘플이 RnaseA를 처리하지 않은 gDNA이고 4번 샘플이 3번 샘플의 일부를 Rnase A 처리한 것입니다. 각 샘플의 purity는 사진 맨 아래에 달아뒀습니다.   1. 1 2 3 번 샘플에서 맨 위에 가장 진하게 뜨는 band가 gDNA band인 것으로 보이는데 아래에 smear하게 길게 끌리는 band는 degradation된 DNA라고 봐야할까요 아니면 샘플에 남아있는 RNA라고 봐야할까요? 2. 3번 샘플 DNA 중 7.8ug을 RnaseA에 반응시킨 것이 4번 샘플인데 4번 샘플의 DNA 양이 약 1.3ug정도밖에 되지 않습니다. Rnase가 이론적으로는 DNA는 분해시키지 않아야 할텐데 RNase A treatment의 영향일까요 아니면 RNaseA treat후 다시 NaOAC와 ethanol로 침전시키는 과정에서 loss가 많이 발생한 것으로 봐야할까요?   최대한 gDNA sample에 RNA를 다 없애고 싶은데 RnaseA treat하고 나니 DNA가 너무 줄어들어있어서 어떻게 해야할지 고민입니다.ㅠㅠ   

Dna prep 시 chaotropic salt로써 GB(guanidine buffer)를 사용 중인데 guanidine 중에 어떠한 부분이 실리카의 수소결합을 깨고 binding이 되는건지 궁금하네요ㅠ 아니라면 구아니딘의 역할과 GB 버퍼 내에 어떤 부분이 실리카와 binding시켜주는건지 궁금합니다!

구강상피세포dna 추출실험을 진행하게 되었습니다. DNAzol이 없는데 자체제작 하는 방법이 있을까요? 계면활성제랑 소금(?) 이용해서 DNAzol 만들 수 있다고 들어서요

DNA추출 실험을 할 예정인데 없어서 나중에 주문하고 지금 당장 있는 스핀 컬럼을 이용하려고 합니다. 큰 지장이 있는지 선배님들의 의견주시면 감사하겠습니다.

Double-stranded DNA fragments 안정성 테스트를 하고 싶은데요.. IDT에서 현재 판매하는 gblocks 개념으로 보시면 될것같은데, 여기 사이트에서는 cloning 하는 자료만 있드라구요 저희는 cloning 은 하지 않고, Double-stranded DNA fragments 형태로만 안정성을 확인하고 싶습니다. 저희는 Fragment Analysis  기계를 사용하여 안정성을 확인하고 싶은데 1. base 마다 안정성의 차이가 있는지 2. Fragment Analysis 로 안정성 확인이 되는지 조언 부탁드립니다!

LB와 Skim milk를 Autoclave에 돌릴때 왜 같이 섞어서 돌리지 않는지 이유가 궁금합니다

안녕하세요 dsDNA Fragment 관련하여 질문합니다 위와 같이 올리고를 합성해서 PCR 한 다음 T7 Endonuclease 처리를 하고 Gel cutting 을 하는데 왼쪽은 오른쪽 template 농도의 4배를 한 그림입니다. 근데 막상 cutting 후, gel elution을 했는데 농도가 1~2ng/ul 정도 똑같이 낮게 나오드라구요.... 농도를 높이고 싶어서 template 농도의 4배를 한것인데.... 농도가 1~2ng/ul 밖에 안되서 자꾸 농도도 흔들리고 원래 gel elution을 하면 농도가 이렇게 낮게 나오나요???? 현재 사용하는 키트는 QIAGEN Gel Extraction kit 입니다. 원래 cutting 하고 elution 하면 낮은건지 ... 좋은 답변 부탁드립니다    

재조합된 transformation후에 colony를 따서 pcr을 진행하였습니다. 그후에 band걸어보니 insert가 2000bp인데 왜 저렇게 100bp미만으로나오나요? 사이즈확인후에 충격먹었습니다 기존 insert pcr시에 dmso를 넣고 gibsson으로하여 phusion polymerase로 pcr을 진행하였습니다. colonypcr할때 바로 전기영동 저사진은 기존과 다른 taq polymerase로 사용하였습니다 그래서그런지 저렇게 band가 이상한건가요? 저band는 도대체 왜저사이즈로 나온거죠 ...? 추가적인 질문을 드리자면 insert가 2kb고 벡터가 5kb되는데 왜 콜로니pcr일때 insert 사이즈 2kb만나오고 5kb는 안나오나요?