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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein
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Q. antibody
western blot에서 antibody를 새로 찾고 있는데 abcam에 "Recombinant Anti-OOO + OOO antibody" 이렇게 두개의 타겟 단백질 항체가 써있는건 뭔가요?
회원작성글 멍게  |  2022.12.15
Q. transfection시 fugene 역할
Bacmid miniprep후 농도측정시 0.1ug/ul. Bacmid10ul + fugene 3ul +midia100ul 를 6well에 sf9 cell과 transfection해두었습니다. 그런데 bacmid 농도 재 측정시 2ug/ul입니다.ㅠ 백미드 10ul 사용했으니 Fugene양이너무 적은걸까요? 다시 transfection 하는게 좋은지요? 이것 5일후 infection 할 수 있는걸까요? Fugene의 역할이 뭔지 궁금합니다. 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  2022.12.14
Q. 프라이머 시퀀스만 보고 뭔지 알 수 있나요?
5` cat cat cac cat cac cac ... ... ... ... ... ... ... cat cat cac cat cac cac 3`    이게 뭔지 알고 싶은데 이것만 가지고 뭔지 알수 있나요?  
회원작성글 gksdnfl  |  2022.12.13
Q. 단백질 발현시 엔자임 선택 첨부파일
프라이머 제작할때 2개 엔자임을 선택하려고 하는데 엔자임이 인설트와 벡터에 다있는 애를 골라야한다고 하더라구요. 그럼 이렇게 되있는 경우 엔자임을 어떻게 선택해야되는건가요??
회원작성글 gksdnfl  |  2022.12.13
Q. 희석 맞는지 확인 부탁드립니다ㅠㅠ
ELISA 키트를 사서 해봤는데 detect 범위가 5pg/ml~1500pg/ml이라서 키트 내에 있는 STD와 제 샘플로 calibration을 진행해봤습니다. STD는 잘 나오는데 제 샘플은 모두 blank(D.W)와 동일하게 나왔습니다. STD는 잘 나오는걸 보니까 실험 과정 중에 이상은 없는 것 같고 샘플 문제인 것 같은데 희석을 잘 했는지 확인 부탁드립니다ㅠㅠ 1mg/ml 용액   -1/100희석 (10ul +990ul DW) - 10ug/ml -1/100희석 (10ul +990ul DW) - 100ng/ml -1/100희석 (10ul +990ul DW) - 1ng/ml   이렇게 샘플을 1ng/ml로 만들어서 반씩 희석해서 calibration 용액을 제조했습니다. 희석 문제가 아니라면 제 샘플이 이 키트에 안맞는다는 것 같은데 확인 한 번만 부탁드립니다ㅠㅠ
회원작성글 hj1226  |  2022.12.13
Q. soft/hard inclusion body에 대해 궁금합니다
라이소자임과 같은 단백질이 변성된 후 리폴딩 되는 과정에서 inclusion body가 생기는 것으로 알고 있는데 여기서 inclusion body가 정확히 무엇이며 그 종류가 soft와 hard로 나뉜다고 하는데 각각은 어떠한 특징이 있으며 이 두 종류의 inclusion body를 준비하는 방법에 대해 알고 계시거나 관련 논문을 알고 계시다면 답변 부탁드립니다.
회원작성글 gogogogogo..  |  2022.12.12
Q. DH10bac과 SOCmedia
bacmid만들기위해 DH10bac cell로 transformation합니다. 항생제는 genta,kana,tetra 3개사용한 플레이트 에 도말. heat shock 42C 45초 후 아이스에 2분 뒀다가 soc media넣고 3시간 incubation후 플레이팅하던데 LB media,2xYT media는 사용하면 안되나요? 꼭 SOC만 써야하는지요? 감사합니다.
회원작성글 BBlue  |  2022.12.11
Q. 히알루론산 피부 침투 관련 질문이 있습니다.
피부 최외각층인 피부각질층은 보통 500달톤 미만의 물질만이 침투된다고 알려져있습니다. 그래서 피부침투능력을 지닌 히알루론산과, 피부약효물질을 화학적으로 결합시켜 피부에 도포하는 방식으로 침투시키려 합니다. 제가 궁금한점은 이때의 피부약효물질이 500달톤 이상 약 900달톤 정도인데, 히알루론산이 피부침투능력을 가지고 있긴하지만 기본적으로 분자량이 큰 물질과 결합되었을 때 어떻게 피부속으로 끌고 내려가는지 궁금합니다.. 이론상 히알루론산과 결합되었을 때 물질을 둘러싼 히알루론산에 의해 끌려갈 수 있지만, 조금 더 생각을 해보니 피부각질층에 걸려서 히알루론산만 흡수되고 분자량이 더 큰 유효물질은 흡수되지않고 표피층에 잔류할 것 같습니다. 화학적 접합과정을 거쳤기에 각각의 분자량이 크던 작던 상관이 없는건가요 답변 해주시면 정말 감사하겠습니다 !
회원작성글 12312  |  2022.12.11
Q. SDS page gel 이 굳지 않습니다 ...
실험실에 예전에 누군가가 사놨던 시약들로 웨스턴블롯 실험 구축중에 있습니다 없는 시약들은 다 주문했지만 원래 있던 시약은 유통기한이 다 지나긴 했어요.. bis acrylamide는 실험실에 없어 acrylamide만 30%로 녹여서  gel을 만들었고 나머지는 모두 조성대로 실험을 진행하였습니다..(bis acrylamide는 구매예정입니다..) gel이 굳지는 않고 끈적끈적하게만 유리판에 달라붙어있는 상태입니다ㅜㅜ TEMED와 APS의 농도를 높여도 보았고 실험실 온도도 높여 잘 굳는 환경을 조성해봤지만 10시간이 지나도 gel이 굳지않습니다ㅜㅜ 우선 의심가는것들은 bis acrylamide를 넣지않은 점, 상해버린 시약인데 ,, 선배님들은 gel이 굳지않는 이유를 어떻게 생각하시는지 여쭙고싶습니다
회원작성글 도비에용  |  2022.12.09
Q. SDS-PAGE 실험 결과 해석 부탁드립니다. 첨부파일
첨부한 사진은 SDS-PAGE 실험 결과입니다. 이 실험을 처음 해서 결과를 어떻게 해석하는지 모르겠습니다. 자세하게 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 펭귄뒤적  |  2022.12.08
Q. 웨스턴 밴드 사이에 세로선 질문입니다 ㅠㅠ 첨부파일
안녕하세요..! caco2 cell로 웨스턴 분석 후 밴드 사이에 저렇게 칸막이 처럼 세로선이 생겨 내려오는데 따로 이유가 있을까요?  같은 조건의 다른 샘플도 p-stat6 분석 결과가 저렇게 칸막이쳐서 나오네요..  p-stat6 분석한 결과이고, Tris-glycine 10% 젤을 사용했고,  2x SDS sample buffer 사용하여 protein 얻은 후  소니케이터 -> 98도에 끓여 보관된 샘플을 20ul 로딩했습니다 ㅠㅠ ... transfer 후 blocking 은 2시간 상온 -> 1차 ab overnight 4도씨에 진행하였고 이후 wash 는 5분씩 3번 했습니다..ㅠㅠ 원인이 무엇일까요?...
회원작성글 mingudam  |  2022.12.08
Q. 안녕하세요 % 단위를 IU/ml 로 환산하는 공식을 알고싶습니다.
응고인자 검사중에 %로 표기되는 장비가 있는데, 저희는 IU/ml를 사용합니다.   이 때 단위환산을하고 싶은데, 공식이 어떻게 되는지 잘 모르겠습니다.   도움부탁드려요.
회원작성글 Hippo90z  |  2022.12.08
Q. protein boiling
1. protein purifiction했고 SDS-PAGE 하기위해 Protein sample boiling할 때 95c- 5분하는데 80c -10분,  70c- 15분 이렇게도 괜찮은걸까요? 2. 그리고 boiling후 바로 젤 런 못할경우 보관은4c 와 -20c 어느게 적당한지요? 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  2022.12.08
Q. western band가 smear하게 나옵니다.
안녕하세요, 벌써 석사 4차 된 대학원생 입니다.   지난 2년동안 대부분 fraction으로 cytoplam과 nucleus를 분리하여 protein을 뽑았었고 RIPA buffer는 거의 안썼었습니다. 쓸 일이 있어도 다른 선배님꺼를 사용했으며 제가 직접 만들어 쓴게 얼마 되지 않은데 추측상 그 이후부터 밴드가 끌려 보이는거 같습니다. 다른 밴드들은 괜찮은데 a-tubulin만 끌려 보입니다.   그래서 정량도 제대로 안돼보이고 교수님 보여드리기 부끄럽습니다ㅠㅠ   protein lysis 과정은 간단하게, cell을 tube에 모으고 RIPA buffer를 양에 맞게 넣고, ice에서 10분 후 14000rpm으로 15분 돌려줍니다. sonication은 처음에는 했었다가 어느순간부터 안하고있습니다. 아마 sonication을 안했기 때문일까요? 아래는 같은 protien으로 내린 다른 밴드 사진 입니다. 여태 protein 뽑는걸로 고민한적이 없었는데 무엇이 문제일까요ㅠㅠ    
회원작성글 신짜오  |  2022.12.07
Q. protein dialysis를 하려고 하는데 제가 하는 방법이 맞는 지 알고 싶습니다
안녕하세요 protein dialysis를 하려고 하는데 제가 하는 방법이 맞는 지 알고 싶습니다 우선 프로토콜은  chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://static.igem.org/mediawiki/2019/4/47/T--CSMU_Taiwan--proteindialysis.pdf 를 사용할 계획이구요. 왜냐하면 정제 할때 이미다졸을 많이 사용할 것이기 때문입니다. 그리고 Spectrum™ Labs Spectra/Por™ 7 50,000 D MWCO 표준 RC 전처리 투석 키트를 사용해서 투석을 할 예정인데 이유는 50kD미만의 단백질이 target 단백질이기 때문입니다. 제가 혼자서 실험을 꾸려나가는 거라 아직 부족한 점이 많습니다. 많은 조언 부탁드립니다.
회원작성글 bio1296  |  2022.12.07
Q. Western blot sample preparation 시 protein 농도가 낮게 나오는 문제의 해결방안
안녕하세요. 화학과에서 western blot 실험을 진행중인 한 대학원생입니다. 이 글을 작성하는 이유는 제목에도 적혀있듯이 제가 항상 western blot sample을 preparation하는 과정에서 최종 BCA assay를 통해 얻는 protein의 농도가 너무 낮은 점에 대한 해결책을 찾고 싶어서 입니다.   우선 저희 연구실에서는 western blot용 cell seeding을 12 well에 1.0x105개 하여왔습니다(thermo plate seeding density를 기준으로 한 것). Media는 DMEM/F-12를 사용하였고 culture volume은 1 mL였습니다. seeding 후에는 24 시간 culture 후, 기존의 media를 suction하여 주고 compound를 녹인 media (final DMSO 0.1%) 1 mL를 넣어 추가로 8시간 혹은 24 시간 culture를 진행하였습니다.  그리고 time point에 따라 그 시간이 되면, media를 제거한 후 ice-cold PBS, 500 µL로 3번의 wash를 진행하고, 100 µL의 Lysis buffer를 treat하여 4 도씨에서 30분간 agitation진행하였습니다. 그 후, 현미경으로 모든 세포가 떨어진것 및 세포벽의 형태가 사라진 것을 확인한 다음, scrapping하여 1.5 mL tube에 담아 16000 g에서 40분간 centrifuge합니다. 최종적으로 sup.을 따서 BCA assay를 진행하는 식으로 진행하게 됩니다. 그 결과 저희는 최대 0.6 mg/mL 정도의 단백질 농도만을 얻을 수 있었는데, 다른 실험자 분들의 예시를 여기저기서 찾아보면 이보다 월등히 높은 농도로 (20~30 mg/mL) lysate를 얻고, 실제 WB의 protein loading amount도 40~50 µg 정도 되는 것을 보면 저희의 lysate 농도가 매우 묽음을 항상 느낄 수 있었습니다.   Lysis buffer는 thermo의  RIPA buffer (Cat#: 89900)과 merck사의 Roche cOmplete Mini tablet (11836143001) 제품을 mix하여 만들어 줍니다. cOmplete Mini tablet의 경우는 1 tablet을 1.5 mL DW나 100 mM phosphate buffer에 녹이면 7x 농도라서 이를 RIPA와 6:1로 mix하여 사용합니다. 이때 RIPA에 포함된 1% NP-40이 묽어져서 그런것인가 생각되어 애초에 tablet을 RIPA buffer에 녹여 lysis buffer를 만들어 사용도 해보았지만 농도는 똑같이 묽었습니다.   혹시 이런 현상을 겪어보신 적이 있으신 분이거나 이 현상에 대한 해결책이 떠오르시는 분은 조금만 지혜를 빌려주시면 감사하겠습니다. 항상 sampling을 할때마다 농도가 낮게나와서 실험을 진행하지 못하는 것이 너무 답답하기만 한 상황입니다. 해결책을 찾고싶습니다.    읽어주셔서 감사합니다. 
회원작성글 서롤  |  2022.12.07
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