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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
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Q. Double staining 시에 어떻게 antibody를 mix 해야하는지 궁금합니다.
제가 IF를 하려고 합니다. double staining을 해야하는데 첫번째 primary Ab : Goat anti-mouse IgG 이고 (1:100으로 dilution 해서 썼고)두번째 primary Ab : Goat anti-rabbit igG 입니다. (1:200으로 dilution 해서 썼음)첫번째 secondary Ab : Goat anti-rat dyelight550(red) 이고두번째 secondary Ab : Goat anti-rabbit FITC conjugated 입니다.이 두가지의 primary Ab와 secondary Ab를 어떻게 mix를 해야 하는지 궁금합니다.secondary의 host는 같아서 두가지를 mix 해도 상관이 없는것 같은데 primary도 secondary 처럼 그냥 mix 해서 사용해도 되는지 궁금합니다.고수님들 답변주세요
교활한아이  |  2012.05.22
Q. primary antibody의 background가 많이 심합니다..
p53를 잡기위해 immunoprecipitation 후에 sample을 electrophoresis와 transfer를 거쳐membrane으로 옮겼습니다.다른 antibody들은 괜찮았는데 유독 제가 쓰는 p53 antibody만 멤브레인 전체적으로 넓게 background가 잡히는데요..ㅜㅜnonspecific 밴드가 잡히는 것도 아니고 멤브레인 전체적으로 dot들이 보이면서원하는 밴드를 정확하게 볼수 없을 정도로 덮어버립니다..blocking은 한시간으로 하고 있고 primary antibody incubation 후에도떼어내려고 열심히 wash를 세게 여러번 하고나서 secondary antibody붙여도 계속지속이 되네요..무엇이 문제일까요?? 
회원작성글 jossiah  |  2012.05.09
Q. IF 할때 double staining 을 하고 싶은데요 .
저는 돼지 embryo에서 IF 를 하고 있는 학생입니다.zygote 단계에서 parental origin을 확인하는 실험을 하는데요제가 갖고 있는 두 개의 primary antibody가 있는데이것들의 secondary antibody가 모두 FITC 입니다.그러면 double staining 을 해도 confocal로 봤을 때 확인이 어려울 것 같은데요나머지 하나의 secondary는 dylight 나 FITC 가 아닌 다른 걸로 구입을 해야하겠죠?구입하지 않고 FITC로 그냥 염색 할 수 있는 방법을 없을까요?
궁금한 아이  |  2012.05.03
Q. 동물실험 내용중
논문을 읽다 이해가 안 되는 부분이 있어 질문 드립니다. OOO was injected ip at 2, 6, 10, 14, 18 or 22 hour after the light wsa turned on (HALO) mice위와 같은 문장이 있는데 HALO가 어떤 의미 인가요??이후에도 논문 내용중에 2 HALO, 4 HALO 등의 단어가 등장하는데 어떤 의미인지 궁금합니다.
ahffk  |  2012.04.30
Q. IP 실험에서 cross liked 문제.....
처음으로 글을 올리는거 같습니다. 질문을... 현재 IP실험을 하고 있는데 자꾸 cross-liked가 되어서 heavy 와 light chain이 잡힙니다.예를 들면 마우스 FLAG으로 IP를 해서 IB를 rabbit을 했는데 heavy chain 부분이 잡힙니다.근데 여기서도 정말 이게 heavy chain인지 아닌 bead의 non specific binding인지 잘 모르겠지만. 전 후자라고 생각합니다.현재 사용하는 bead는 산타 protein agarose A/G bead를 사용중 입니다.pre-cleaning을 해도 그 heavy chain의 부분이 계속 적으로 나타 납니다.혹시 bead의 문제 인지 아님 내 손이 문젠가? ㅋㅋㅋㅋ혹시 괜찮은 bead 잇으면 추천좀.. 솔직히 bead빼고는 해볼만한건 다해본듯.....세컨 안티 바디도 바꿔보고 그리고 cross activity 없는 세컨도 써보고 그리고protein A-HRP 도 써보고 했는데도 그 부분이 자꾸 잡히네요... 
스마맨  |  2012.04.23
Q. IP할때요
flag, HA tagging된 protein을 한꺼번에 IP하려고 하는데같은 튜브에 flag bead와 HA bead를 동시에 넣고 진행해도 될까요?IP가 처음이라 모든것이 생소하네요 ㅠㅠ
유학생  |  2012.03.30
Q. Chromatin fraction 찰싹 달라 붙어 있는 Insoluble protein들 IP..
제목 그대로 Chromatin fraction 에만 박혀 있어서, 일반적인 NP40,Triton derived Non-denaturaiting buffer나 RIPA 등으로는 잘 용출되지 않아서, W/B시에 Sample buffer로 깨야 용출되어 나오는 단백질들을 IP하고 싶을 때 어떻게 실험해야 하는지 감이 안잡히네요.. 브릭님들의 의견을 듣고 싶습니다..  부족한 이 실험자에게 많은 코멘트 부탁드려요! 
실험하자!!  |  2012.03.18
Q. immunopurification과 immunoprecipitation의 차이가 뭔가요
논문 method 보면 분명히 나뉘어서 설명되어져있는데막상 구글링해보면 비슷한 내용 같네요;무슨 차이가 있는건가요? 
회원작성글 식당  |  2012.02.28
Q. 간 손상 실험하시는 분들께 여쭤보려 하는데요..^^;
제가 CCl4를 이용해 간손상 마우스를 만들어서 실험을 하고 있는데요보통 IP injection으로 cell을 넣어주고요번에 portal vein으로 cell을 넣어줘봤는데 생각보다 효율이 별로더라구요근데 논문을 찾아서 읽다보니 spleen에 injection한다는 논문이 있어서..왜 spleen에 하는지.. 그리고 spleen  injection이면 배를 열고 해야 되는거 아닌가요?혹시 spleen injection 해보신분 계시면 답변 좀 부탁드릴께요..^^
회원작성글 huen44  |  2012.02.27
Q. Co-IP 질문요
cell 에 endogenous 하게 존재하는 두 protein 을 Co-IP하려고 합니다Co-IP 시 2차 안티바디가 틀린 안티바디를 각각 사용해야 한다고 알고있는데2차가 rabbit으로 똑같아요 이경우 어떻게 하죠??두 프로테인 사이즈는 틀립니다그냥 해도 되나요??
봄이오기를  |  2012.02.25
Q. Imunoprecipitation 첨부파일
안녕하세요 이제 대학원 1학년생으로 실험을 진행하고 있는데 결과가 잘 안나와서 조언좀부탁드립니다.ㅠ.ㅠIp를 진행 중에 있는데 결과가 자꾸 안나와서 미치겠습니다.우선 vector 는 pEGFP-C2 에 유전자를 Cloning 해서 Transfection 후에 진행 하고 있습니다.4 well confocal 은 마쳐서 Transfection 효율은 어느정돠 확인했는데100 파이 plate 에서 IP trasnfection 후 RIPA 버퍼로 Cell lysis 후 (보통 6-10시간정도 진행합니다.) GFP Anti body 를 6시간정도 반응시키고 A/G agrose bead 6시간 반응후 Ripa 로 2회 washing . PBS 로 2회 washing 후 5X loading buffer 를 넣고 끓인후 SDS page 한 결과 입니다. GFP 밴드가 나온다면 26Kda 정도에 동일하게 떠야 되는거 같은데 자꾸 45KDa 정도 위치에동일한 Band가 나타나고 위아래로 잡 band 들이 나와서 .. 왜 이런지 도저히 모르겠습니다.제가 뭐 잘못한다거나 빠트린게 있는게 아닌지 고수님들 도와주세요
회원작성글 찬이  |  2012.02.21
Q. DsRed vector에 넣고 DsRed로 IP실험 하나요??
제가 EGFP-X와 DsRed-Y 를 overepression시킨다음에 Co-IP 실험을 하려고 하는데요...GFP로는 IP실험을 하는데..RFP로는 IP를 안하는거 같아서요.. 괜찮겠죠??
회원작성글 qkittyp  |  2012.01.13
Q. IP할때 negative control로 사용하는 IgG 어떤걸 사용해야하나요?
Immunoprecipitation을 하려고 하는데 관련실험을 거의 해본적이 없어서 프로토콜을 봐도 잘 모르겠네요ㅜ.ㅜIP할때 negative control로 IgG를 사용한다고 논문에 써있던데 antibody를 말하는건가요?아니면 IgG serum을 말하는건가요?저희 실험실에서는 human IgG(millipore)가 있는데 이건 serum이더라구요그런데 web site검색하니까 mouse-anti-human IgG4라고 있던데 이걸 써야하는건지...아니면 저희가 일반적으로 W.B할때 사용하는 secondary antibody를 써야하는건지 잘 모르겠네요.고수님들 답변 부탁드려요.^^
알쏭달쏭  |  2011.12.21
Q. IP할때 cell lysate, preclean bead 보관 며칠 가능한가요??
 제가 cell lysate와 preclean bead를 만들고 4도에서 4일정도 보관하였는데요나중에 IP한 sample에서 RNA도 추출해야하는데그냥 다시 하는게 좋겠지요??
회원작성글 식당  |  2011.12.12
Q. immunoprecipitation troubleshooting
처음으로 immunoprecipitation을 수행하였습니다.i.p를 한뒤에 detection하고자 하는 antibody를 붙이고 현상을 하였는데 깨끗하게(?) detection이되지 않았습니다. ㅜㅜ혹시나 I.P를 잘못한 경우로 membrane에 protein이 없는것이 아닐까하고, ponceau S staining을 했는데, 어떠한 band도 보이지 않았습니다.이럴땐,,bead의 문제인가요? (1st antibody affinity는 최강임..1:10,000으로 이틀이면 붙어요)
회원작성글 궁금이  |  2011.12.05
Q. IP antibody, bead rotate 하루만에 할 수 있나요??
제가 듣기로는 affinity만 좋으면 하루만에 진행할 수 있다고 들어서요..원래는 antibody O/N하고 bead처리해서 4시간 rotate하였는데 band가 선명했거든요급하게 IP를 해야하는데 antibody 4시간, bead 1시간 처리해서 하루만에 진행할 수 있을가요??효율이 좀 낮겠지요??
늅  |  2011.11.30
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