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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Transfection
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Q. Transfection 후 dish에 이상한 하얀 덩어리들 첨부파일
안녕하세요 현재 HEK293 Cell에 PEI transfection을 진행하고 2일 후 dish를 확인해보니 밑에 사진과 같이 하얀 덩어리들이 존재하고 몇몇데는 중간에 구멍도 났더라구요 현미경으로 봐도 잘 모르겠어서 질문 올립니다 전에는 분명 저런거 없이 깔끔하게 cell로만 뒤덮였는데혹시 cell이 오염된걸까요..? Cell을 녹여서 사용한지는 최근이라 오래되서 그런건 아닐테고.. ㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 냥뮹  |  2021.10.16
Q. cell 회사에 따른 transfection 효율 차이?
cell transfection 관련으로 질문합니다!ㅠㅠ 전에 키우던 cell이 pass 횟수가 너무 많아져서 버리고 새 cell stock을 풀었습니다 같은 cell이긴 한데 회사가 다르더라구요ㅠㅠ 전에 했던 실험이랑 동일한 방법, 동일한 양으로 DNA, reagent로 transfection 했는데 전에 했던 cell과 다르게 너무 많이 죽었습니다ㅠ 혹시 cell 회사가 다르다는 이유로 이런 차이가 보일 수 있나요? 그게 아니면 제 실험과정 중에 문제가 있었던 걸까요ㅠ
회원작성글 우르롹끼  |  2021.09.27
Q. THP-1 cell에 si RNA transfection 실험 하시는 분 계신가요?
HEK 293T cell에 siRNA를 이용해 gene knockdown을 하여 실험하다 같은 siRNA와 같은 transfection reagent를 이용해 THP-1에 실험을 하니 knockdown이 5번 중에 한 번 성공할까 말까 하는 성공률을 보이고 있습니다. 안정적인 knockdown 성공률을 위해 이런저런 시도를 해보았으나 아직 성공률을 높이는 방법을 찾지는 못했습니다.  일단 기본적으로 si RNA와 dharmafect를 각각 serum free RPMI에 풀어 10분간 둔 뒤, 둘을 섞어 25분 뒤 세포에 처리하는 식으로 transfection을 하고있으며 knockdown 여부는 transfection 이후 48시간이 지난 뒤 qRT PCR로 knockdown 여부를 확인하고 있습니다. si RNA의 농도를 10µM ~100µM까지 조정해보거나 dharmafect를 2배 혹은 0.5배로 처리하거나 25분의 대기시간을 45분까지 늘려보거나 24시간 이후 siRNA를 한번 더 처리하는 식의 변화를 각각 줘봤는데 아직까지는 성공한 방법이 없네요... 혹시 THP-1에 siRNA를 이용한 transfection 해보신 분 중에 노하우 공유 가능하신 분 있을까요? ㅠ
회원작성글 5시반엔배가고프다  |  2021.09.07
Q. cell tranasfection 할 때
transfection 할 때 OPTI-MEM이랑 Lipofectamine2000 사용하는데 시약의 역할이 뭔가요?! 실험에서 어떤 역할로 쓰이는지 궁금합니다.
회원작성글 jizz  |  2021.08.31
Q. Subcellular localization 할때 형광발현이 안되는 경우
안녕하세요 일개 대학원생입니다. 현재 target gene을 pAcGFP-N1 vector에 ligation하여 세포에 transfection하고 형광현미경으로 subcellular localization 관찰 중입니다. 여러개의 다양한 유전자를 실험 중인데요, 일부는 잘 발현되어 이쁜사진이 찍히는 반면 일부는 형광이 발현되는 세포가 없는것처럼 보입니다. 실험 방법도 동일하고 제 생각에는 크게 이상이 없는것 같은데 왜 안되는건 안될까요.. 잘 발현되지않는 경우가 있는것일까요..? 이런 경우에 해결 방안이 있을까요..? 도와주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 줌수  |  2021.08.22
Q. GFP 형광(transfection) 질문드려요 첨부파일
   안녕하세요  제가 plasmid vector 제작하여 transfection을 진행하였습니다(ampicillin, GFP)  stable cell line 만들기 위해 ampicillin 2배농도부터 10배 농도까지 처리하여  1x10^5로 100mm dish에 seeding하였습니다.  2-3일로 ampicillin 포함하여 미디아 체인지 하였습니다.  GFP 형광발현이 전체적으로 이루어지지 않고 일부분만 보이는데  일반 현미경으로보면 cell은 죽어나가지 않고 계속 자라 confluency는 70-80% 차있습니다    이게 transfection과 stable cell line이 형성 된건가요?  처음하는 실험이라 서툰게 많은데 선배님들의 조언 부탁드립니다 ㅠㅠ    
회원작성글 듈리  |  2021.08.19
Q. 테라토마와 스키드 마우스
면역결핍쥐와 일반쥐에 줄기세포를 넣을 시 둘 다 테라토마가 형성된다. 면역결핍 쥐에서 생긴 테라토마를 분리하여 새로운 일반 쥐에 삽입 시 테라토마가 형성되지 않는다. 일반쥐에서 생긴 테라토마를 분리하여 새로운 일반쥐에 삽입 시 다시 테라토마가 형성된다는데 그 이유를 모르겠습니다....  
회원작성글 새콤둥이  |  2021.08.17
Q. siRNA & shRNA Transfection 실험
현재 대학원 생활을 하고 있는 학생입니다. siRNA or shRNA Transfeciton 하여 knockdown이 잘 되었는지 확인하는 실험을 진행을 하고 있습니다. 실험을 하는 도중에 질문이 있어 이렇게 글을 올리게 되었습니다. Transfection 이후에 RNA를 뽑아서 cDNA 합성을 하고 Real time PCR을 통해서 knockdown이 잘되었는지 확인을 하고 있는데 RNA를 뽑고 나서 농도를 측정해보니 높게 나오는 sample들도 있지만 아주 낮은 농도로 추출되는 sample들이 있는데 대체적으로 siRNA or shRNA Transfection을 하고 RNA를 뽑을경우에 sample들의 농도가 어떠한지 궁금합니다. 그리고 또한 A260/A280의 흡광도 비율도 어떠한지 궁금합니다.
회원작성글 후기대학원생  |  2021.07.28
Q. 형광현미경 관찰 시 mounting과 그 외의 것들 질문입니다.
안녕하세요 일개 대학원생입니다. 요즘 subcellular localization 실험 중인데요, 형광현미경 관찰에 관한 질문이 있습니다. 실험 과정은 다음과 같습니다. coverslip에 cell을 seeding하고 target gene+GFP vector를 transfection한 후 배양하고 포르말린고정, DAPI 염색 후에 mounting, 현미경관찰로 진행중입니다. 수용성 지용성 두가지 모두 mounting을 해보았는데 특히 수용성으로 한것을 관찰할 때 녹색형광이 엄청 번져?서 형광관찰이 잘 안되더라고요. 간혹 기포가 있어서 mounting이 잘 안된곳을 관찰하면 번지는 느낌 없이 아주 어두운 background에 형광이 선명하게 나타납니다.. mounting 과정에 문제가 있는것일까요..? 또 DAPI 염색이 끝난 후 washing을 하고 바로 mounting을 하는데 혹시 완전히 말린 후 mounting을 해야하는 것일까요? 선배님들의 답변 기다립니다..감사합니다.
회원작성글 줌수  |  2021.07.23
Q. 형광현미경 관찰 시 mounting과 그 외의 것들 질문입니다.
안녕하세요 일개 대학원생입니다. 요즘 subcellular localization 실험 중인데요, 형광현미경 관찰에 관한 질문이 있습니다. 실험 과정은 다음과 같습니다. coverslip에 cell을 seeding하고 target gene+GFP vector를 transfection한 후 배양하고 포르말린고정, DAPI 염색 후에 mounting, 현미경관찰로 진행중입니다. 수용성 지용성 두가지 모두 mounting을 해보았는데 특히 수용성으로 한것을 관찰할 때 녹색형광이 엄청 번져?서 형광관찰이 잘 안되더라고요. 간혹 기포가 있어서 mounting이 잘 안된곳을 관찰하면 번지는 느낌 없이 아주 어두운 background에 형광이 선명하게 나타납니다.. mounting 과정에 문제가 있는것일까요..? 또 DAPI 염색이 끝난 후 washing을 하고 바로 mounting을 하는데 혹시 완전히 말린 후 mounting을 해야하는 것일까요? 선배님들의 답변 기다립니다..감사합니다.
회원작성글 줌수  |  2021.07.23
Q. 대장암 세포주 transfection 후 contamination 때문에 고민입니다.
저는 현재 대장암 연구실에서 통합과정 학생으로 지내고 있습니다. 실험 진행 중인 세포주로는 DLD-1, LoVo 그리고 SW480을 가지고 miRNA와 관련된 연구를 진행하고 있습니다. 몇 달 전부터 계속해서 cell line contam과 관련된 문제 때문에 고민입니다. 갑작스럽게 감염 증상을 보이다보니, 어떤 것들? bacteria인지 효모 인지 정확히 모르겠습니다... 보여지는 모습으로는 길쭉하게 생겨서 뱀처럼 꾸물꾸물 움직이거나, 작고 동그랗게 생겨서 활발히 움직이는 것들 이렇게 2 종류로 예상됩니다.   Material들은 새로 만들거나 구매한지 얼마 되지 않았고, filter tip도 사용해보고 pipette도 다른 것들을 사용하는 등 여러 가지 조건들을 계속 바꿔가면서 해결해보려 노력하였지만, 계속해서 contam되고 있습니다. Transfection에 주로 사용하는 material 들로는 Gibco의 RPMI, FBS, penicillin/streptomycin 그리고 Opti-MEM과 Lipofectamin RNAiMAX를 사용하고 있습니다.    특히, transfection 이후 10% FBS media (free-antibiotics)로 교체해주니 p/s가 없어서 그런지 확실히 눈에 띄게 움직이는 것들이 증가하는 것을 확인하였습니다. 동영상이 업로드 되지 않아 캡쳐하여 올립니다.  업로드하는 사진의 경우, SW480 세포주를 6well plate에 seeding 해서 몇 가지 테스트를 해보았습니다. 조건들로는, 1. 10% FBS RPMI media에서 48hr 키운 것: 적지만 움직이는 것들 보임 - SW480 세포주 자체가 먼저 오염된 것으로 판단하여야 하는 것인지...? 2. Opti-MEM에 48hr 키움: 처음보는 종류의 오염, 길쭉한 것들이 뱀처럼 꼬물꼬물 활발히 움직임 3. Lipofectamin RNAiMAX 처리 후 24hr 뒤 media change 한 것: miRNA mimic이나 siRNA KD 시킨 것들이 주로 비슷한 모습을 보임, 작고 비교적 동글동글한 것들이 활발히 움직 4. miR-NC transfection 후 24hr 뒤 media change 한 것   혹시 감염된 것들이 정확히 무엇인지, 그리고 관련된 문제를 해결할 수 있는 방법이 있는지 궁금합니다.  몇 달 동안 시달려서 실험 진행에도 많은 차질이 생기고 있어서 답답합니다. 관련해서 경험이 있으시거나 이러한 문제를 해결하신 분들의 많은 의견을 부탁드리도록 하겠습니다.
회원작성글 enthusiasm  |  2021.07.17
Q. Bleomycin selection 질문드립니다.
  안녕하세요.저는 올해부터 실험을 시작하게 된 새내기 입니다. 다름아니라, 제가 요 vector를 transfection 후 selection을 하려고합니다. marker는 bleoR 이렇게 되어있어서, bleomycin을 사용하려고 하는데, 실험실에  zeocin이 있어서, zeocin으로 selection을 해도 되는건가요??
회원작성글 종종종종  |  2021.07.13
Q. crispr cas9 고수님들 도와주세요
transmembrane protein을 crispr cas9 system을 이용하여 ko시키고 있습니다.  selection후 western으로 확인을 했을때 계속 ctrl 에서보다 overexpression된 상태로 band가 확인이 됩니다... 이런경우도 있을까요.....?? 왜 ko을 시켰는데 ctrl에서보다 over되어서 나오는지 모르겠습니다..ㅠㅠ 그리고 membrane에있는 receptor여서 lysis과정에서  ice incubation후 14000rpm으로 다운을 안하고  그냥 바로 정량해서 sampling을 하였는데 receptor확인시 이렇게 sampling을 하는것이 맞을까요?? crispr cas9 고수님들 도와주세요.  
회원작성글 석사.  |  2021.07.03
Q. EGFR overexpression vector에 관한 질문입니다.
안녕하세요. 학위과정중인 학생입니다.    제가 요즘 A549 cells를 가지고 항암 실험을 하고 있는데,  A549 (EGFR normal expression) cell에 EGFR를 과발현시켰을 때 해당 약물이 똑같이 효과를 가지는지 확인하는 실험을 진행하려고 합니다.  EGFR overexpression vector를 검색해보았을 때 EGFR vector만 나와서.. overexpression vector가 아닌 EGFR vector를 구매해도 overexpression 이 되는 건가요? 제가 vector관련 실험은 처음이라 많이 낯설어서요..  선생님들의 답변을 기다립니다.  감사합니다 
회원작성글 딸판바  |  2021.06.28
Q. Electroporation 으로 동물세포에 plasmid DNA 도입시에 linearaze 하는 이유가 뭔가요...?
안녕하세요, 얼마전 유전자 cloaning 및 transfection 실험을 진행했는데요 E.Coli 로 EGFP를 도입한 Plasmid vector 를 만들어서 추출한 다음에 동물세포에 electroporation 으로 도입하는 실험이었는데, 이때 추출한 plasmid DNA 를 제한효소로 linearize 했었거든요 조사해보니까 어떤 논문은 supercoil 형 DNA가 오히려 도입효율이 좋다고 하고, 또 어떤 논문은 linear 형이 더 안정적으로 도입된다고 하는데 어느쪽이 맞는건가요?ㅠㅠ 그리고 linear 형이 도입이 더 안정적인 경우에 그 이유는 뭘까요...? 
회원작성글 정윤오와이프  |  2021.06.23
Q. SWITCHGEAR GENOMICS 회사에 대한 질문이 있습니다.
안녕하세요. SWITCHGEAR GENOMICS 라는 회사의 시약을 주문하려고 하는데, 홈페이지 상에선 한국지사 혹은 대리점이 없네요. 혹시 이 회사 제품을 구매하신 분이 계시다면, 어디를 통해 주문하셨는지 알 수 있을까요? 좋은 하루 보내세요.
회원작성글 처음처럼  |  2021.06.15
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