hMSC cell에서 hCOL1A1을 target으로 하는 primer를 제작하여 qPCR을 돌렸는데 melting curve가 2개 나옵니다. 총 6well에 했는데 6well 모두 multi하게 나옵니다. 심지어 2개 peak의 값이 각 well에서 조금씩 상이하게 나옵니다. TM은 똑같아요. 혹시몰라 sample gel에 전기영동 내려서 band 확인했는데 band는 one band로 나옵니다.... 이게 뭐가 문제인지 알 수 있을까요

안녕하세요. 인턴으로 일하고 있는 대학생입니다.   이번에 두 종류의 Plasmid를 Maxi prep 하게 되었는데요. 하나는 1800ng/ul에 purity는 1.91로 잘 나왔지만   다른 plasmid는 315ng/ul에 purity는 1.90, 260/230은 2.15로 결과가 심하게 차이가 났고, 이번에 다시 문제의 Plasmid들만 다시 2번의 maxi를 더 했으나 둘 다 purity는 1.90에 300ng/ul 언저리로 나와 질문드리고 싶어 작성하게 되었습니다..   실험의 경우, protocol 진행에 있어 1800ng/ul과 300ng/ul 두 pL의 다른 점은 없었습니다. 16시간 배양 후, 첫 centri에서의 pellet은 1800ng/ul의 pL이나 문제의 pL이나 모두 같은 양이 추출되었으나, 마지막 TE로 녹이기 전 Centri에서의 pellep 양은 확연한 차이가 발생하였습니다.   특히나, 개인적으로 궁금한 점은 흡광도에서 A260과 A280값이 1800ng/ul = 37, 19 300ug/ul = 6.3, 3.3 이렇게 나오는데, 이 경우 DNA의 양 뿐만이 아니라 Protein의 양도 적게 나왔으니, pL이 transfection 된 양이 적은 것이 아니라 protocol 진행에 미스가 났다고 봐도 되는걸까요..!   또한, pL 종류에 따라 최종 Yield 차이가 많이 날 수도 있는건가요??  

JASPAR등과 같은 사이트에서 특정 gene에 대한 특정 Transcription factor의 binding을 prediction하면, 어떤 T.F A같은 경우에는 promoter 기준 전후로 굉장히 많은 prediciton site가 나오고 또 다른 T.F. B는 prediction site가 많지는 않지만 promoter 바로 앞부분에 위치한 prediction site가 나오는데요. 기초적인 것일 수도 있는데 문득 이런 의문이 들었습니다. 그렇다면 A가 이 gene에 더 potential한 T.F일지 혹은 B가 더 강력한 inducer일지가 궁금해졌습니다. 경우에 따라 다를 것 같긴 하지만, 둘 중 어느 것이 더 potential하다고 봐야할까요? 

저희 실험실에 NAD 시약 (Molecular Weight:663.43) 250mg이 있습니다. 저희가 필요한 stock의 농도는 100mM 인데 계산을 어떻게 해야 하는 지 질문 드립니다.... 1M NAD로 만들어서 100mM로 만들면 되는건가요?

전기 영동 후 밴드를 잘라서 EP tube에 넣고 냉장고에 보관 후 약 20시간 후에 gel purification을 시작해도 될까요?

promega genome dna purification 키트 사용해서 진행했는데 프로토콜에서 protein precipitation solution 넣고 ice에 넣고 centrifuge 돌린후에 상등액 옮겨서 isoprophenol 넣고 centrifuge 돌리면 pellet이 생겨야하는데 아무리해봐도 pellet 없습니다.. cell양이 적은가해서 양도 늘려서 해봤는데 pellet이 다운이 안되는데 제가 놓친 부분이 있을까요..?

안녕하세요.  qPCR을 primer를 논문에서 찾아봤는데 tamra primer를 사용한 논문을 찾았습니다.  protien F,R primer서열 + FAM-5’ TTCCGGGATGCCGCTGCAAAG3’-TAMRA 알려주었는데 저희 랩은 sybr green을 사용해서 protein F,R서열만 가져와서 qPCR을 해도 괜찮을 거라고 생각이되는데 혹시 안되나요?? 서열 길이를 다 확인해본 결과 70-100bp내외였습니다.   추가적으로 sybr green으로 qPCR을 진행 할 경우 100-200bp내외로 primer을 구상한다고 하던데 250bp정도로 길어지면 문제가 발생 할까요?

안녕하세요 이제 막 랩실에 들어와서 연구실 생활을 하고있는 학부생입니다!  DNA purification 후 얻은 dna로 전기영동을 진행하던 중 질문이 있어서 사진과 함께 질문 드립니다!   Q1. 주황색 박스 안에 있는 밴드는 왜 휘어져있는것인지 궁금합니다! 전기영동 진행 중 책상에 큰 충격은 없었습니다. Q2. 파란 작스 안에 있는 밴드들은 대체로 밑부분이 옴폭 들어가있는데 이같은 개형은 왜 발생되는지 궁금합니다. Q3. 자주색 박스와 초록색 박스안에 밴드가 끝부분에서 두개씩 있는걸 볼 수 있는데 자주색 박스의 반 갈라짐과 초록색 박스의 반 갈라짐이 조금 다른 모습을 보이는데 밴드가 끝부분에서 반으로 갈라지는 이유와 갈라지는 모양이 조금씩 다른 이유가 궁금합니다.   제가 이론이 조금 미숙하여 모르는 부분이 많습니다 알려주신다면 열심히 참고하여 공부하겠습니다, 감사합니다. 혹 전기영동과 관련된 추천 서적이 있다면 추천 부탁드립니다!

안녕하세요. DH5-alpha cell에 FLAG vector를 넣어 transformation 시킨 후, 배지에 키워 콜로니가 생겼고 거기서 약 5개정도의 colonly를 따서 각각 50ml tube에 10ml LB + Ampicillin을 넣고 overnight하였습니다. 이후 가장 잘 자란 놈만 골라서 glycerol stock을 만들고 그 놈을 다시 LB culture 하여 miniprep을 하였는데 DNA 농도가 50ng/ul밖에 되질 않네요... PLKO 등의 벡터를 예전에 뽑았을 땐 200ng/ul정도는 나와줬는데... 특정 Colony만 plasmid yield가 낮게 나올 수도 있는 걸까요 아니면 해당 벡터가 원래 수율이 낮은걸까요..?

시퀀싱보낸 plasmid서열에서 점돌연변를 발견했는데 CGG가 AGG로 바꼈습니다. 워블법칙덕분에 아미노산이 둘다 아르기닌으로 번역되는 걸로 확인해 운이 좋았지만, 이 plasmid안의 insert DNA는 codon optimization을 진행했던거라서 번역과정에서 영향이 있지는 않을까 걱정되는데..... 그냥 써도 되나요?

NCBI를 이용하여 reference file을 생성하고 싶습니다. 해당 그림처럼 원하는 gene의 "intron & exon부위가 모두" cover 되도록 만드는 방법이 있을까요??

람다파지를 이용한 유전자클로닝부분 공부하고있는데요 cos서열이 람다파지 genome의 circular form 형성에 관여한다는건 알고있는데  스샷 설명글을 보면 'cos 자리가 손상된 람다 DNA를 숙주에서 증식하여~'라는 부분이 있습니다. cos자리가 왜 손상되어야 하는지 궁금합니다. 의미가 와닿지가 않아서요....

안녕하세요? real time pcr 련해서 질문이 있어서 글을 남깁니다. 논문 작성에 있어서 Target A와 B 를 real time pcr을 진행하는데에 있어서 같은 cycle로 진행하여 결과를 실어야하나요??? 예를 들어 Target A는 30cycle 쯤에서 Ct 값이 확인되지만 Target B는 40cycle 쯤에서 Ct 값이 확인된다면 둘다 동일하게 40cycle로 진행해서 논문에 실어야 하는지요?? 제 생각에는 어차피 threshold (Ct)값은 변하지는 않을 것이기 때문에 각각 최적의 cycle로 진행하면 된다고 생각하는데 (Target A는 30cycle,Target B는 40cycle)어떻게들 생각하실까요?? 감사합니다.

TA cloning한 plate에서 30개의 colony를 골라 5개씩 묶어 colony PCR하였습니다. 일단 30개를 mini prep을 위해 culture를 시작하긴 하였는데,  첨부파일 같은 결과를 얻었습니다. 혹시 6개 section 모두 되었다고 봐도 될까요? QPCR inner primer로 PCR했을때는 5,6번에서 vector size 정도의 band가 나오고 있어서 이게 된건가 싶기도 합니다. 고수님들의 의견을 부탁드립니다.  

vector, insert, t4ligase 등 모두 문제 없는 걸로 확인되었는데요, cloning 후 확인을 위해 restriction enzyme으로 잘라보면 insert사이즈의 밴드가 안나와요ㅜㅜ 원스텝으로 진행되는 실험이라는데 몇번을 해도 cloning이 안됩니다. 어떤 부분에서 문제가 생긴걸까요?

안녕하세요 회사 인턴생 입니다. 이번에 PCR에 대해 공부하고 있는데 PCR의 기본 원리 작동 방법들은 어느 정도 알았는데 결과 해석 및 그래프 해석하는 방법을 몰라 조언을 구해보려고 합니다. PCR 결과 해석하는 방법이나 그래프 분석하는 방법들을 정리해놓은곳이 있을까요? 일반 PCR , Reverse Transcription PCR , Real Time PCR 들의 결과 해석법 배우는 곳을 알고 싶습니다.

gRNA는 제가 원하는 site 부분만 바꿔서 계속 재사용 될수 있다고 알고있는데요. site (20bp) 부분 뒷쪽에 Reverse primer 5` end에 phosphorylation이 붙은 primer를 이용해서 원하는 site (20bp) 앞쪽 프라이머만 바꿔준다라고 이해하고있는데요. 그럼 원하는 site를 바꿔줄때 site 앞에 부분 서열에 원하는 서열을 넣고 phosphorylation 프라이머와 같이pcr돌리고 dpn1 처리만 하면 되는건가요?

ligation 후 마크로젠에 sequencing 을 맡겨 확인해 볼려고 하는데요. confirm pcr을 돌려 그 부분을 맡겨서 확인하는 거다 라는 것과 그냥 prep후 맡겨서 확인하는거다 라고 각각 선배들께서 알려주셨는데 차이가 있을까요?

벡터맵을 보면   Hinc II,  Sac I, Acc I 3개가 GTCGAC를 인식한다고 표시되어있는데   이게 Isoschizomers 라는 건가요?  

안녕하세요, 이번에 Streptomyces의 한 strain (Streptomyces tendae DSM 40101)을 이용해 실험을 하려고합니다. 여기에 whole genome sequncing data가 필요해서 찾아보니 등재되어 있는 sequencing data는 여러개의 contigs로 이루어져 있네요. Seq. accession number 1932.11의 level은 wgs라고 되어있는데 fasta data를 받아서 열어보면 139개의 contigs로 이루어져있습니다. 이런 경우 whole genome sequence를 구할 수 있는 방법이 없을까요?? 여러분의 도움이 필요합니다 감사합니다.