안녕하세요 3T3-L1으로 지방 분화 실험을 하는 학생입니다.  Bric 선생님들의 도움으로 3T3-L1 분화 하는거까지는 성공을 했는데요,  세포 harvest후 PCR로 측정했을때 MDI 처리 안한 정상군과 MDI만 처리한 군에서의 유전자 발현 차이가 크지 않아요  논문들 보면 MDI 처리 안했을 때 대부분의 유전자들이 발현하지 않던데  제껀 왜 차이가 별로 안날까요?  지방분화는 눈에 띄게 차이가 나고, MDI 처리 안했을 때는 지방이 거의 없습니다.  측정한 gene은 PPAR-r, FAS, LPL, CPT-1이고, PPAR-r에서도 MDI군을 1로 봤을때 미분화군이 0.4-5 정도로 발현이 됩니다.  FAS나 LPL은 미분화군에서 0.6-7정도로 발현이 많이되구요  심지어 CPT-1에서는 미분화군이 아주아주 높게 나옵니다 (10배 이상)  근데도 이렇다면 primer를 다시짜서 해보는게 제일 빠른 방법일까요? ㅠㅠ PCR은 qPCR 장비 이용해서 사용하고있고 SYBR green 형광 이용해서 측정합니다.  Melting curve로 확인했을때 dimer도 없었고, 곡선도 일정했습니다.  Bio-rad에 primer 검토도 받아서 진행한거예요..ㅠㅠ 왜이러는걸까요? 도와주세요ㅠㅠ 혹시 몰라서 지방 분화된 사진 같이 첨부합니다. 

저는 콩팥 특히 질병으로는 신증후군 쪽에 관심이 많습니다. 줄기세포를 통해 신증후군 질병을 치료 및 약효 지속 등 연구하는 쪽에 대학원에 진학하고싶습니다. 화학쪽이 아닌 생물 쪽 으로 가고싶습니다. 인터넷이 많이 검색해봤지만 잘 나오지 않아 브릭에 질문하게되었습니다. 대학원 추천 부탁드립니다

암세포는 보통 접촉저해가 없다고 알려져있는데 예외의 경우가 있는지 궁금합니다. 암세포를 배양하는 과정에서 더 이상 암세포의 수가 늘어나지 않는 모습을 관찰 할 수 있었습니다. 셀컬쳐 플라스크의 크기에 비해 암세포의 수가 너무 많아서 플라스크가 꽉 차게 된다면 더 이상 암세포가 분열하지 않을 수 있나요? 

raw 264.7 cell은 주로 염증 관련 실험에 많이 쓰이는 것로 알 고 있는데요 파골세포로도 분화할 수 있다는 사실을 얼마전에 알게되어서 한번 분화시켜보려고 하는데 프로토콜이 잘 정리된게 찾기가 어려워서 어떤식으로 분화시키는지 알려주실 고수분들 찾습니다 ㅠㅠ

안녕하세요 조무래기 석사생입니다ㅠ T cell을 osteoclast로 분화시키는 게 가능한지 궁금해서 질문올리게 되었어요 현재 jurkat cell을 가지고 실험중입니다. jurkat을 ionomycin과 PMA 처리하여 activation 시켰는데 이렇게 하면 cytokine 발현량이 높아지는 것에서 끝날까요? 아니면 t cell의 다른 cell로의 differentiation이 진행되나요? 가지고 계신 관련 논문이 있다면 추천도 너무너무 감사하겠습니다ㅜㅜ

안녕하세요 Raw cell 파골세포 분화 실험 셋팅중인데, 세포 모양 관련해서 궁금한게 있어서 질문 올립니다.    일단 셋팅중이라서 조건 잡기 위해 raw cell은 p.7로 a-MEM배지 이용해서 24well에 1~3x104cells/mL로 seeding하고 24시간 후에 RANKL 10~100ng/mL포함된 배지로 교체하였습니다.  RANKL은 R&D system 제품이고, 0.1% BSA가 포함된 PBS로 녹인 후 희석해서 처리하였습니다.  현재 RANKL 포함 배지로 1회 교체해주고 배양한 지 2일차입니다. 내일 RANKL 포함 배지로 교체해줄 예정이구요.  아직 morphology에 큰 변화가 없을 시기인 것을 알지만 세포 관찰하다가 궁금해서 질문 드립니다.    1. 첨부하는 사진에서 빨간색 원에 있는 세포는 분화되고 있는 세포가 맞을까요?  2. 노란색 원에 있는 세포는 activation 되는걸까요, 아니면 다리를 뻗고있는걸까요?  3. RANKL을 치지 않은 well에서도 노란색 원에 있는 세포가 보이면 이 세포는 파골세포 분화에 적절하지 않은 상태일까요?    고수님들 답변 부탁 드리겠습니다. 

고등학생들 R&E를 봐주는데, Proliferation을 관찰하고자 합니다.  아는건 MTT assay와 Cell counting인데,  사실 proliferation이라는게, 분열을 빨리하고 빨리자라는거인데,  이것을 관찰할수 있는것이 어떤 실험이 있을까 궁금합니다.    woung healing assay도 가능하겠네요! 

안녕하세요 Transwell assay 를 처음 해 보는 대학원생입니다. Matrigel을 코팅해서 하는 Invasion 말고, migration을 확인 하고 싶어서 시도하였는데 문제가 많습니다 ㅠㅠ 저희 실험실에 있는 프로토콜이 따로 없어서, 혼자 여러 논문을 참고해서 시도 해 보았는데 결과가 계속 안 나와서 질문 드립니다...!   24well plate에 chamber 넣기 200ul cell (3x104/ml in serum-free media) 을 상부 chamber에 넣기 750ul culture media (with serum) 를 chamber 아래에 넣기 Chamber를 culture media를 넣은 well에 핀셋으로 옮기기 37℃ 에서 24h incubation (*약물을 농도 별로 처리) Chamber 안에 배지 제거 PBS에 chamber 담가서 2번 washing 비어있는 well에 chamber를 놓고, 4% paraformaldehyde 로 fixing R.T에서 30min fixing PBS로 2번 washing 100% Methanol로 20 min permeabilization PBS로 2번 washing 새 24well plate로 chamber 옮기기 Giemsa stain solution 넣기 호일로 plate를 감싼 후, R.T에서 20min staining Stain solution 비워내고, PBS로 2번 washing 면봉으로 non-migrated된 cell 닦아내기 (윗면만 살짝) Chamber를 현미경으로 관찰하여, migrated된 cell count 하기 *챔버 바닥 부분만 칼로 도려내어 커버글라스에 올린 후 촬영 이렇게 프로토콜을 만들어서 실험 중인데, 우선 세포 자체가 migration이 안 되는것 같아요 ㅠㅠ 분명 챔버 윗 부분에 세포들이 있는것을 확인 후에, Fixing이랑 staining 단계를 진행하는데 염색 후에 보면 아무것도 남아있질 않습니다..ㅠㅠ 세포 이동속도가 느려서 그런가 해서 1주일동안 방치해도 똑같습니다 ㅠㅠ 다른 분들께 여쭤봐도 프로토콜상에는 큰 문제가 없다고하는데.. 여러가지 바꾸어 봐도 변화가 없습니다.. 실험에 사용한 세포는 HepG2 이고, 챔버 pore size는 8.0 um 입니다.  제일 중요한 실험인데 지금 확인조차 안 되는 상황이라 너무 답답합니다 ㅜㅜ Transwell asaay 고수님들 제발 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠ

안녕하세요 수의학계에서 대학원 다니고 있습니다 제가 얼마전 개의 비장조직으로 세포 분리하여 BD accuri C6 plus 로 분석했는데 결과가 예상햇던 것과 달라서 질문 드립니다.. 입문한지 삼일차에요 죄송합니다.. ㅜ 어느 과정에서 문제가 생긴건지 결과는 어때야 하는지 기본 flow cytometry 참고할 수 있는 논문이나 책 있으면 알려주세요 ㅠ 감사합니다 1. 비장 슬라이드로 짓이겨서 cold PBS로 붙은거 떼주면서 22G 주사기로 조직 곱게 해주고 그걸 cell strainer에 주사기 고무패킹으로 갈았고 그거를300-400g 5분 원심, RBC lysis buffer (BD거) 하고 300-400g 5분 원심, PBS 원심 해서 희석해서 결과 찍었는데 어떤 부분이 잘못 되었을 까요 2. 정상 마우스에서 비장 돌렸을 때 정상적인 그래프 모양은 어떤가요? 3. 제가 실험에 참고할 기본적인 flow cytometry 책이나 논문이나 글 있으면 링크 부탁드립니다ㅠㅠ 너무 기초적인 내용 질문이라 죄송합니다

브릭 회원님들 안녕하세요.    저는 현재 지방세포를 이용한 실험중에 있습니다.   이렇게 브릭에 질문을 올리게된 이유는 제가 실험하고 있는 3T3 L1 세포의 DF 유도가 갑자기 잘 되지 않아 질문을 올리게 되었습니다.   과거에는 유도도 문제없이 잘 진행이 되었으며, Lipid droplet역시 아주 잘 관찰되었습니다.   그러다가 최근 언제부턴가 분화후 세포들이 첨부한 사진의 상태에서 크게 변하지 않는것을 확인하였는데 그 이유를 몰라 진행이 지연되고 있습니다.   세포 배양 및 분화는 1. subculture는 80% confluence에서 진행되었습니다.   2. 세포의 passage는 #5 입니다.   3. DF 조건은, seeding 5 x 10^4 cell이며, seeding 후 2일차에 배지교체를 한뒤 2일 더 배양하였습니다(post-confluency). 이후 분화유도는 1uM Dex, 0.5 mM IBMX, 10ug/ml insulin + 10% FBS 배지로 처리를 하였으며 3일동안 분화를 유도하였습니다. 3일 후, 동인한 농도의 insulin 배지를 처리하여 2일 배양하였습니다. 마지막으로 FBS배지를 처리하여 3 - 4일 배양하였습니다. 4. 분화 유도에서 확인되는 부분은 배지가 끈적거리는 것을 확인할 수 있었으나, droplet 형성이 거의 되지 않네요..   혹시 어떤부분이 문제일까요..?

안녕하세요 C2C12를 키우고 있는데 궁금한게 생겨서 질문드립니다! 보통 C2C12 분화시킬때 2% 농도를 사용한다고는 알고 있는데 간혹 가다보면 5%를 사용하는 논문들도 많더라구요! 그래서 왜 이렇게 다른 농도를 쓰는지 나름 찾아봤는데 이유가 명확히 나온걸 못 찾겠더라구요...ㅜㅜ 제가 궁금한 것은 1. 보통 2%를 쓰는 이유는 뭔가요? 2. 5%를 쓰면 2%와 비교해서 어떤 차이점이 있나요?? (예를 들어서 분화가 더 빨리 된다던가, cell에 데미지를 준다던가..) 3. horse serum의 어떤 물질때문에 근육이 분화 되는건가요? (혈청 기아 상태에서도 분화가 되는건 알고있습니다. 그런데 그 상태로는 단백질 발현이 적은데, HS를 썼을때 무엇때문에 단백질들이 잘 발현되면서 분화가 되는걸까요?_?)

Oil red o staining을 프로토콜 찾아서 오늘 처음 진행했습니다. 저는 세포를 사용해서 염색을 진행했고, 10% Formalin으로 30분간 고정 했는데 고정 후 보니 세포가 다 부유되어서 더 이상 염색을 진행하지 못하였는데 무엇이 잘못되었는지 알 수 있을까요?   고정까지의 과정은 다음과 같습니다. 1. 세포 배양액 제거 2. DPBS 2회 wash 3. 10% Formalin solution으로 30분~1시간 고정 3번 이후 세포가 다 부유되어 있었습니다. 10% formalin은 Formaldehyde solution을 D.W에 1:10으로 dilution하여 제작하였습니다. 조언 부탁드립니다. 감사합니다.

  선배님들,,  엑소좀 완전 완전 초보인 석사생입니다... 혹시 D-Exosome과 P-Exosome의 차이를 알 수 있을 까요...   알려주시면 정말 정말 감사드리겠습니다.

안녕하세요, 랩에서 MSC osteogenesis 확인으로 alizarin-red staining을 합니다. 프로토콜을 보던중에 quantification 위해 sample 준비 과정에서 acetic acid 를 넣는데 산을 넣는 이유가 무엇인가요? 칼슘이 산에 잘 녹아나오는건가요..? 아시는분이 계실까하여 질문남깁니다! 감사합니다~ 

안녕하세요! 랩에서 adipogenesis 확인으로 oil red o staining을 합니다. protocol중에서 PFA 고정 이후에 60% Isopropanol로 washing 과정이 있는데 이때 왜 D.W가 아닌 isopropanol을 사용하는지 궁금합니다. 감사합니다!!

안녕하세요. H9C2 rat cardiomyocytes와 AC16 human cardiomyocytes로 beating 유도 실험을 계획하고 있는데 관련문헌이 거의 없어서 경험자 분들께 문의드립니다.   만약 beating 유도가 가능하다면, BMP4 등이 첨가된 특수 분화배지가 필요한건지, 혹은 마우스배아줄기세포처럼 자발적 분화가 가능한지 궁금합니다.   감사합니다!