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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
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Q. scale up할때 중요한것
scale up 할때 제일 중요한것이 어떤건가요.? 감사합니다.
회원작성글 full story  |  2015.01.25
Q. scale up할때 중요한것
scale up 할때 제일 중요한것이 어떤건가요.? 감사합니다.
회원작성글 full story  |  2015.01.25
Q. IP관련하여 여쭤봅니다 :( 첨부파일
IP를 처음해보는 초보석사과정입니다.A protein과 B protein이 서로 interaction하기에 co-IP를 하는 중입니다.A 항체로 IP를 하고 B 항체로 WB를 하였습니다.A는 rabbit polyclonoal, B는 mouse monoclonal입니다.앞에 두 줄이 negative control입니다.첫번째줄은 normal rabbit IgG를 사용하였고두번째줄은 IgG 사용없이 Protein A agarose만 넣은 것 입니다.일단 negative control에 band가 뜬 것만으로도 handling이 잘못된것이라고 혼났습니다.normal rabbit IgG를 넣은 sample에서 band가 떴을 때는 heavy chain, light chain 이 분리되서 그럴수도 있겠구나, 라고생각하였지만aga만 넣은 sample에서도 band가 뜬 것은 IP가 제대로 되지 않았다고 생각이 됩니다.제가 한 프로토콜은1. Protein A agarose 20ul X sample 수 만큼 tube에 넣고 IP buffer로 wash를 3번 하여 pre-clearing과정을 하였고,2. 새로운 tube에 protein 200ug + Ip buffer 를 넣어 총 volume 600ul를 만든 후 pre-clearing 한 aga를 20ul씩 넣어 4℃ 1시간 shaking incubation 하였습니다.3. spin down 시켜 sup을 따는 과정을 2번 하였고4. pre-clearing 한 aga 20ug과 Ab 10ul(약 2ug)를 넣어 4℃ overnight shaking incubation 하였습니다.5. sup 따서 버린 후 wash buffer 1ml로 10min씩 inverting하여 wash 4번을 하였고, 남은 resin의 1:1정도로 3x SDS-PAGE buffer넣은 후 boiling 7min 후 spin down 시켜 WB를 시행하였습니다.IP buffer는 20mM Tris, 100mM NaCl, 0.5% NP-40, 0.5mM EDTA, pH=7.5Wash buffer는 10% NP-40, 2.5% deoxycholic acid, pH=7.4의 조성으로 사용하였습니다.혹시 이 protocol에서 어떠한 문제가 있는것인지, aga만 넣은 negative control에서 band가 뜨는 이유를 알 수 있을까 하여질문을 해 봅니다.감사합니다.
5911  |  2015.01.13
Q. control IgG에 의해서도 IP가 될수있나요..?
NIH3T3 cell에 Flag를 태깅한 유전자를 transfection 하였습니다 그리고 lysate를 둘로 나누어서 하나는 Flag 항체(mouse)로, 하나는 control normal mouse IgG(santacruz 제품)를 넣고IP를 진행했구요,, 물론 IgG는 negative control 입니다. 그런데 western 후, Flag 항체로 확인했을 때 negative control 에서도 거의 동일하게 밴드가 뜨는데요..flag 뿐만 아니라 이 유전자와 interaction하는지 확인하려고 했던 두가지 유전자 밴드도 똑같이 밴드가 뜨네요.. 이 중 하나는 co-IP를 통해서 이미 interaction을 확인한 유전자입니다. light chain(LC) 이나 heave chain(HC)과는 사이즈가 차이나기 때문에 이건 아니고,두 그룹 모두 LC HC 밴드 뜬 것은 확인했습니다. non-specific band라고 보기에는, Input도 같이 로딩 해서 사이즈 확인했기 때문에 유전자 밴드가 맞구요,IgG를 2차 항체가 잡을 수도 있겠다고 생각했는데,IP한 항체와 host가 다른 항체를 사용했기 때문에 그럴 가능성도 없는거 같아요..왜 이럴까요 ㅠㅠ  상층액 깨끗이 제거했고 washing도 6-7번 정도 수행했습니다. ㅠ 조언부탁드립니다. ㅠ
학생  |  2014.11.28
Q. proteolytic enzyme assay 실험 도와주세요
제목과 같이 단백질가수분해효소 실험중입니다  기질은 casein 으로 사용중입니다280nm에서  해리되는 ring compound amino acid를 (예 tyrosine) detection 하고 있는데요궁금한것은 해리되는 tyrosine의 양에 따른 O.D 값의 변화입니다  쉽게 생각해서 두 샘플간의해리된 tyrosine이 1ug차이가  난다면 O.D값은 얼마나 차이가  나는지요?참고한  논문까지  같이 적어주시면  감사하겠습니다 
정광진  |  2014.11.21
Q. 답변 좀 부탁드려요!조직에서 IP-mass 분석 질문 있습니다! 첨부파일
현재 A 라는 E3 ligase의 target 을 찾으려고 IP mass 준비하고 있습니다.다른 연구자들처럼 293t에 overexpression 해서 Flag bead 로 IP를 하니A 단백질의 cleavage form이 너무 dominant해서 mass 찍은 결과 실패하였습니다..결론은 endogenous 한 단백질로 IP 를 해야겠다라고 생각을 했고제가 지금 가지고 있는 A유전자의 KO을 이용하면 어떨까 생각했습니다.먼저 IP가 되는지 확인하기 위해 A 유전자의 발현이 높은 조직인 brain heart lung 의조직을 lysis하여 IP를 한 결과 brain heart 에서는 IP가 되지 않았는데 Lung 에서는 IP가 잘 된 것을 확인하였습니다.IP는 12mg 정도 진행을 하였습니다. 사진은 첨부하겠습니다.나온 band 중에 항체에 대한 non specificdl 있을 수 있어 Wildtype과 KO lung 에서의 Band 비교도 가능 할 거 같긴 합니다만..제가 궁금한건..조직에서 IP 하여 target 을 발견한 논문은 찾을 수가 없는데..그 이유가 몬지 알고 싶습니다.IP 자체가 안되서 그러는건지 아니면 다른 이유가 있는건지 궁금합니다.
회원작성글 CK  |  2014.11.20
Q. 항체 이용한 실험에서 His tag vs HA tag ?
실험실에 두가지 테그의 항체를 보유하고 있습니다. 모노클로날 입니다.IP, Western, IF 등의 실험을 진행하고자 하고 있습니다.타겟 단백질은 막단백질입니다.위 두 테그 중 어느것이 좋을까요?
작성자  |  2014.11.05
Q. Co-IP, IP시 protein G/A bead와 함께 당기기위한 Antibody를 몇 ug씩 넣으시나요?
제가 일단 실험하는 과정을 말씀드리면60파이에 Transfection한 cell을  200ul의 lysis buffer로 cell을 깨고IP용으로 200ul(lysis buffer) + G bead 40ul + Abtibody 2ug씩 넣고 진행합니다.WB을 진행하면 밴드는 나올 때가 있지만 나오지 않는 경우가 더 많아서혹시나 IP시 사용 하시는 antibody와 bead의 양을 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 Ferredoxin  |  2014.10.23
Q. SDS-PAGE에서 밴드가 흐리고 broad하게 나타납니다 첨부파일
단백질로 SDS-PAGE를 하고 Coomassie blue로 염색을 시행했습니다농도는 0.2%, 0.5%로 sample buffer와 함께 20μl, 10μl씩 로딩했고 gel 농도는 10%를 사용했습니다.문헌 상으로 예상되는 밴드의 위치는 10-20kDa, 40-60kDa 인데요제가 염색한 겔을 보면 10-20kDa 부근에는 전혀 밴드가 없는 것 같고40-60kDa 부근에서는 broad하게 염색이 진하게 나타나는 부분이 보이는 것 같습니다.band를 더 명확하게 보려면 어떻게 해야할까요?그리고 겔의 제일 위쪽이 진하게 염색되는것은 그만큼 내려오지 않은 단백질이 많다는 것일까요??단백질은 disulfide bond를 환원제를 이용하여 깨고 추출하였는데 다시 형성되어서 거대해졌을 가능성도 있을것 같습니다.개선 가능한 부분 조언해주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠ
회원작성글 돌체비타  |  2014.10.22
Q. IP 전반적인 step확인 부탁드려요~
IP 결과가 안나와서 고생하고 있습니다. 브릭 게시판 참고하면서 이것 저것 바꿔서 해보고 있는데 잘 안되네요~"A 단백질과 B 단백질이 결합한다는 결과를 Y2H에서 확인을 했다"는 것을 교수님께 듣고 IP로 확인을 하려고 합니다. MCF10A 세포에 A 단백질을 over expression시킨고, 여기에 B 단백질이 결합하는지 확인을 하려고 하는데요. NP40 buffer로 cell lysis 하고, 정량하고 500 ug으로 시작을 했습니다. mouse anti-A 단백질 항체 1:50으로 lysate에 넣어주고 O/N, 4도 반응  다음날, pre washing한 Pierce protein A/G magnetic beads를 25ul씩 각 tube에 넣어주고 1hr RT 반응  이후에 TBS(0.05% tween20)으로 3회 washing하고, 4x LDS sample buffer (invitrogen) 60 ul를 넣고 95도 10min heating 각 well에 25ul씩 2회 loading (A 단백질, B 단백질)western blottingA 단백질 size 약 55 kDaB 단백질 size 약 29-35 kDalane 1: control HA plasmid DNAlane 2: A 단백질-HA plasmid DNA
회원작성글 미깡  |  2014.10.01
Q. 제가 맞게 실험하고 있는건지 봐주세요..ㅠ
현재 protein-protein interaction을 보기위한 실험을 진행중에 있습니다. 293T cell에 두 유전자에 tagging한 plasmid를 넣어주고 1:1 interaction을 확인했는데요,(유전자 A,B라고 설명하겠습니다.)endogenous interaction을 보려고 NIH3T3 cell을 가지고 실험을 하려고 했는데,A유전자가 이 세포에서 발현을 하고있지 않아서 A유전자만 transfection을 해서overexpression을 해주었습니다. B유전자는 endogenous하게 발현하고 있었구요,마찬가지로 1:1로 interaction을 하고 있었는데논문에 쓸 때, endogenous interaction을 확인했다.. 라고 써도 되는건가요..? 고만하고 있는 이유는, 전혀 발현하고 있지 않았던 A유전자를 임의로 overexpression 시켜준것이기 때문입니다.. 이 유전자가 발현하고있는 세포를 따로 구해서 다시 실험을 해야하는건지요 ㅠ논문을 쓰고 있는데 갑자기 고민이 되네요ㅜ 조언 부탁드립니다..
학생  |  2014.09.24
Q. epitope tag 선별 방법
안녕하세요 현재 Sox2와 어떤 단백의 결합을 알아보기 위해 co-ip 실험을 끝내고, 디펜스를 준비하고 있는 학생입니다. HEK 293T에서 실험했구요. 몇가지 질문에 답해주시면 대단히 감사하겠습니다.Sox2의 N-terminus에 HA를 붙여서 실험을 했는데, HA 말고 다른 epitope tag을 쓸 수 있는건가요?검색을 해보니 epitope tag이 immunoprecipitation 에 이용되는 tag인 것은 알겠는데, 아무리 찾아봐도 FLAG, Myc, HA 등이 어떻게 선별되어 사용되어지는지 잘 모르겠네요. Beads는 Dynabeads protein G (magnetic) 를 사용했습니다. 
김태하  |  2014.09.19
Q. ip시 nonspecific bind와 incubation time관련 질문합니다
지금껏 수행했던 조건은 lysate와 bead를 섞은뒤 약 14~16h정도 진행하였는데..wb해본결과 bead결합전 결합후 큰 차이가 없습니다 몇몇프로토콜을 본결과 bead 의 antibody도 blocking을 하는거 같은데 이 경우 nonspecific 이 줄고 보다 많이결합할수 있는지 궁금하며incubation시간을 지금보다 더 늘리면 확실하게 결합하는것을 늘릴수 있을지 조언부탁드리며그외 여러가지 binding efficiency를 늘릴수 있는 요소들이 뭐뭐있을까 여쭤봅니다
회원작성글 스턴건  |  2014.09.16
Q. GST pull down protocol 관련 질문입니다.
박사 1년차 초보입니다. 교수님께서 GST pull down을 하라고 과제를 주셨습니다.예전에 protein purification을 본 적은 있지만 직접해보는 것은 이번이 처음이네요.각종 protocol을 비교해보던 도중에 사용되는 PMSF/IPTG/lysozyme 농도가 각각 다르다는 것을알게되었습니다. 아는 선배님께서는 경우에 따라 최적농도가 달라질 수 있기 때문이라고 하셨는데요. 브릭 선배님들의 경험에서 나온 이야기를 듣고 싶습니다. 가장 많이 사용하시는 농도라든지 혹은 최적농도를 설정하는 방법이나 팁을 주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 Tay  |  2014.09.02
Q. ELISA 정량을 하려고 합니당.
실험이 처음인데요... rat serum을 가지고 interferon gamma 농도를 구하라구요... ELISA 정량을 하려고 합니다. ELISA kit를 가지고하는데.... standard curve는 protocol 보고 따라할 수는 있는데 당황스러운게... serum인 sample을 가지고 어찌 해야될지 멘붕입니다.원액으로 하는건지 아니면  희석배율로 하는건지 고수님들 희석배율이라던지 버퍼라든디 조건을 어찌해야될지 알려주세요 ㅠㅠ protocol 봐도 모르겠습니다...
회원작성글 실험초보녀  |  2014.09.02
Q. cysteine carbazole assay에서..
안녕하세요 석사 1학기 하고 있는 학생입니다.xylose isomerase 실험 하는데 assay로 cysteine carbazole method를 사용하는데요질문드리고 싶은 것은 흔히 말하는 Blank에서 그러니까 기질 metal ion 넣어주고 대신에 효소 넣어주지 않는것에서동일하게 효소 반응온도에서 반응하고 이를 이용해서 발색반응을 하면 이론적으론 색깔이 안나와야 되잖아요..그런데 자꾸 색깔이 나오는게 문제입니다..ㅜㅠ어떻게 하면 Blank에서 색깔이 안나오게 할 수 있을까요?참고로 xylose 농도는 200 mM, metal ion 농도는 20 mM입니다. 고수님들의 아낌없는 충고 부탁드리겠습니다.
회원작성글 소도둑  |  2014.08.11
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