안녕하세요 PCR실험을 할때 비특이적 밴드가 잡혀서 annealing 온도를 2도씩 올리면서 실험을 하고 있는데요. Tm값은 59도 이고 55도로 실험을 했을때보다 57도 59도로 실험을 했을 때가 더 잡밴드가 많이보입니다. 보통 온도를 높이면 primer와 template간의 mismatch가 감소해서 반응 특이성이 증가하여 잡밴드가 오히려 사라진다고 알고있는데요... 저처럼 이런 경우도 있나요?? 알려주세요!!

고등학생인데요, 이전에 과기원에서 애기장대에 특정 유전체를 넣어 노화 억제를 확인하는 실험을 진행했습니다.  과정에서 개념적으로 헷갈리는 부분이 있습니다.. 처음 gis cloning 단계에서  promoter sequence pcr을 진행하고, floral dipping을 했고 Tdna insertion 단계 막판에 T dna insertion line을 pcr 했는데 .. 대체 두개가 무슨 차이인건가요ㅠㅠ gdna 안에 tdna가 일부 포함된..? 그런 느낌인가요? 실험단계명에는 t dna insertion line phenotyping이라고 되어있는데, gene cloning 개념에서는 '식물체의 전체 DNA를 제한효소로 절단시킨 Genomic DNA를 플라스미드, 박테리오파지 등 유전자 운반체인 vector에 부착시켜 박테리아나 기주세포에 도입한 다음 박테리아나 세포의 증식과 더불어 도입한 특정 유전자를 대량 증식시키는 것' 이라 되어있어서... tdna와 gdna는 아예 다른 것으로 봐야할까요..? 결과적으로는 애기장대에 Genomic DNA를 삽입한것으로 말해도 되는지 궁금합니다 ((전반적인 cloning 과정에 대해서 설명해주실수있나요..? pcr이나 electroporation같은건 다 알고있는데, 처음 prep한 유전자가 뭔지, 그 전후로 어떤 유전자를 주입한것인지 디테일한것을 잘 모르겠어요 검색해도 잘 안나오고.....))  

pcr product를 백터에 ligation했고 확실히 확인하기 위해 시퀀싱을 하려고합니다.   다들 어느회사에 시퀀싱을 맡기시나요?

형질전환과정에서 궁금한게 생겨서 질문들비니다 컴셀에 kanamycin저항성이 있는 백터를 섞어주고 ice에 30분 반응 후, 42도에 90초 heat shock하고나서, 얼음에 1분박고, LB media에서 1시간 배양하는데 근데 1시간 배양할때, 그냥 LB media를 써야하나요 아니면 LB+kanamycin media를 사용해야 하나요? 그냥 LB media를 계속 써왔는데 궁급해서 물어봅니다

TA cloning 진행 중인데,  X-gal 도포한 plate에서 white colony가 떠서 sequencing을 보냈는데 공백터로 나옵니다. 왜 그럴까요? insert 농독가 단단위대로 낮기는 했는데, 그래도 molar ration 맞추어서 넣은건데 그렇습니다.    

선배님들 제가  Development of a rapid and sensitive reverse transcription real-time quantitative PCR assay for detection and quantification of grass carp reovirus II 논문을 읽고 있는데 도저히 이해되지 않는 table이 있어서 질문 올립니다,, table 3번이고 표에서 의미하는 +, -가 무엇에 대한 pasitive이고 negative인지 모르겠고 왜 이런 결과인지를 도저히 논문만 읽고는 이해가 되지 않네요,,   제가 많이 부족한가봅니다 아시는분 설명 부탁드립니다ㅜ  

안녕하세요.   관련 배경이 없는 상태에서 methylation data를 해석해보려니 어려움이 있어 글 올려봅니다.    현재, 혈액 샘플에서  gDNA추출 후 bisulphite, PCR, 시퀀싱 (2 colony) 처리하여 특정 target region의 시퀀스 2개에 대한 메틸화 수치 값을 뽑은 상태입니다.   여기서 메틸화 수치를 해석할 때, 2개의 colony에서 뽑힌 각각의 메틸화 수치는 평균을 내야 하는지요 아니면 별도의 데이터로 보아야 할지요? 처음엔 두 colony의 메틸화 수치를 평균 내야하는 것이 맞겠다고 생각했었는데,샘플 n수가 적어서 걱정하고 있던 차에 colony를 최소한 3개 이상으로 늘려서 재분석해보라는 답변을 받아서 (blood sample이 1 botttle씩 더 남아있는 상황입니다.) 평균값을 사용하는 것이 잘못된 것인지 의문이 들었습니다.    매우 초보적인 질문이지만 답변 주시면 감사하겠습니다.  

유전자 클로닝을 할때 벡터에 삽입하기 위해서 EcoRi로 제한효소 처리를 하잖아용   처리하고나면   5'-G         AATTC-3' 3-CTTAA          G-5'   이렇게 약간 좀 복잡하게 되잖아용?     근데 T-벡터라는 녀석은 ..... 벌어진 부분에 T만 한 개 달랑 추가된건데,   점착성 말단보다 모양이 훨씬 더 간단해보이는데....    T-벡터만 쓰면 되는거 아닌가요?   실전에선 다들 T벡터만 쓰게되나요??

1. 위은 사진처럼 ct값은 비슷하나 rfu값이 차이가 나서 문의 드립니다. 같은 튜브에서 반복시험한것인데 저런차이가 왜 발생했을까요? 사용해도 되는 결과일까요? 2. 그래프가 눕는?현상이 발생하였는데 이유가 궁금합니다.   

안녕하세요 전 생태전공 석사과정이고 동물의 배설물에서 나온 식물 종을 동정하며 어려움을 겪던 중 메타바코딩, edna, dna 클로닝 같은 방법들을 알게 되었습니다. 배설물이나 위내용물, 바닷물 한컵을 통째로 분석해서 거기있는 종을 다 알 수 있더라구요.   한 줄기 빛이 보이는 것 같아서 공부해보면서 위 방법들에도 많은 제약이 있다는걸 알게되었습니다. 크게 보면 데이터베이스의 부족, 마커선택, 프라이머의 제작이 큰 걸림돌인 것으로 이해했고 제 나름대로 해결책을 제시해봤는데 제가 잘 이해한건지, 비전공자인 제가 현실적으로 실현 가능한건지 궁금합니다.(실험기기나 분석비용은 지원이 가능합니다.)   1. 데이터베이스 : 제가 연구하는 동물은 초식동물이며, 식생조사를 통해 배설물에서 나올만한 먹이식물들의 계절별 출현종리스트(데이터베이스)를 만들어둔 상태입니다.   2.  마커선택 : 이 부분이 정말 어려운 것 같아요. 종간변이가 크면서, 종내변이는 작고 게놈상에서 동일 위치에 존재하는 마커가 이상적이라고 하는데 출현종 40종의 염기서열을 프로그램 돌려서 그런 마커를 찾을 수 있을까요? 안된다면 일반적으로 많이 쓰는 rbcL을 쓰면 어떨까 싶습니다.   3. 프라이머 제작 : 위에 출현한 종 40종을 강(class)수준으로 분류하면 유니버셜프라이머를 만드는건 어려울까요? 강은 8개정도 나올 것 같습니다.    어떤 조언과 충고, 질책 모두 감사히 받아들이겠습니다. 많이 가르쳐주세요.

다른 DNA는 잘들 뽑히는데 유독 갑각류에서만 DNA가 깨져서 스미어하게 나옵니다 ㅠㅠ.. 다른 sample들보다 PCR도 잘 안되고 NGS시에도 contig가 짧습니다. 혹시 DNA 추출에 내공이 있으신 분들은 어떻게 하시나요?   * 해양 갑각류에서 속살로 하면 기생충이 나오고, 껍질로 하면 뿌옇게 섞이지 않은 탄산칼슘(으로 추정되는)이 나오더라구요. 농도나 순도도 정확히 않은것같아 찝찝하고요..   뭐라도 좋으니 아무 조언이라도 부탁드립니다..   

안녕하세요. 저희 연구실에서 이번에 dPCR을 도입하게 되어 2(Beta)-Mercaptoethanol을 취급하게 되었습니다. 그런데 2(Beta)-Mercaptoethanol을 주사기로 그냥 뽑아서 비커에 담으면 후드 안인데도 불구하고 상당히 독한 냄새가 나서 이를 어떻게 병에서 꺼내어 이용할지 어려운 점이 많습니다. 혹시 2(Beta)-Mercaptoethanol을 이용하고 계신 선배님들은 어떻게 사용하고 계신지(주사기 등) 궁금해서 질문 드립니다. 항상 감사드립니다.

안녕하세요. 제가 ligation product를 가지고 DH5a에 형징전환 후 콜로니 6개를 따서 colony pcr을 했습니다. 그 후 전기영동으로 결과를 확인했는데 6개 중에 3번 콜로니만 밴드가 나왔더라구요. 근데 교수님께서 하나만 나온게 이상하다고 다시 한번 pcr하라고 하셔서 다시 pcr후 전기영동 했습니다. 1번때 pcr 결과 (3번콜로니만 밴드 확인됌.) 2번째 pcr 결과인데, 1,3,4,5번 콜로니에서 밴드가 나왔습니다. 이번엔1,3,4,5,번 콜로니가 밴드가 나오더라구요.  근데 저번에 밴드가 하나 나왔던 3번이 제일 진했고, 나머지는 밴드가 연하게 나왔습니다. 혹시 농도가 다른 이유가 있을까요? 콜로니는 모두 똑같이 따서 pcr 했습니다. 2번째 pcr결과(3번 만고도 1,4,5번 콜로니에서 밴드 확인됌.)

TA에 ligation 하고 transformation 진행 한 후 prep 해서 Enzyme cut 해서 확인했는데 밴드가 5~6kbp 하나 750정도에서 하나 떠요. 이상한건 제 insert 가 750 정도라 괜찮은데, TA vector가 2.7kbp 로 알고 있는데 자꾸 그 두배가량 되는 사이즈가 확인되어서요. DH5a 에 TF 했고, T4 ligation kit으로 진행했어요

제가 pET32a vector를 transformation 까지 끝내고 LB 10ml씩 해당 vector의 항생제와 함께 키웠는데 잘 자라서 현재 4°C에 보관중에 있습니다. 이것을 stock 잡아 놓으려고 하는데 어떻게 해야 할 지 잘 모르겠습니다.  보통 vector를 LB배지에 키웠을 때 stock하는 방법이 어떻게 되나요?

제가 한 sanger 실험에서 결과가 다음과 같이 나와서 환자의 아빠가 친부가 아닐수도 있다고 생각했는데,, 교수님께서는 친부가 아니거나 mosaicism 때문이라고 하셨거든요.. 근데 mosaicism 때문에 저런 결과가 나올수 있다는게 이해가 안되어서 누가 어떻게 mosaicism 이면 저렇게 아빠에게 없는 T가 나올수 있는거죠? 차마 여쭤볼수 있는 분이 없어서 여쭙습니다 ㅠㅠ 환자나 엄마가 mosaicism 이라는 걸까요?   

구강상피세포를 추출한 후 pMCT118 프라이머를 사용하여 pcr 한 걸로 전기영동을 진행한 결과입니다. 대조군으로 100bp와 1kb를 활용했는데 결과를 어떻게 분석해야 하는지 모르겠습니다. 위치상 100bp와 1kb를 비교해서 무엇을 알 수 있나요? 그리고 bp를 알고난 후 각각의 구강세포 dna에 대해 어떤 결과를 얻을 수 있을까요?

pcr 할 때 dNTP, Taq polymerase는 무슨 역할을 하나요? DNA template와 Primer1(F)와 Primer(R)의 차이는 무엇인가요?

안녕하세요  제한 효소 반응을 통한 클로닝 과정에 궁금한 점이 있어 글을 남깁니다. 제가 기존에 두 종류의 enzyme을 사용하였을 때 버퍼 조성이 맞아서 두 enzyme을 동시에 반응을 시켰는데요, 요번에 사용하고자 하는 enzyme들은 동시에 반응 시키지 못해 한번 반응시키고 끝나면 다른 enzyme으로 반응 시켜야 할 것 같습니다. 그럼 이때 한번 enzyme으로 자르고 나서, gel purification을 하고 또 enzyme으로 자르는 것인가요? 아니면 enzyme 반응이 끝난 샘플을 원심분리해서 상층액을 제거한 다음 다른 enzyme(+ buffer)를 넣어 반응시켜주는 것인가요?   제가 생각하기엔 하나의 반응이 끝나면 그 tube안에는 DNA+buffer+DDW로 인해 volume이 많을 것 같은데 아무래도 그 tube에 다시 enzyme과 buffer를 넣어주는 것은 아닐거 같아서 여쭈어봅니다. 답변을 위해 시간 내어주셔서 감사합니다.

안녕하세요 이번에 Flag tagging된 protein을 연구하고 있는데 실험실 내에 이미 만들어진 Flag X(protein) vector가 있더라구요 근데 Transfection 시 Flag도 안뜨고 Protein도 차이가 없어서 Vector에 문제가 있는지 sequencing을 하고 싶은데 (물론 Transfection의 문제가 있을 수 있음) Vector transformation 후 miniprep하여 protein에 관해서 sequencing을 요청했을 때, 맞는 결과를 얻었는데, 혹시 Flag를 sequencing 요청할 수 있나요?? 그렇다면 primer를 어떻게 짜야 할까요??