enzyme digestion이 무슨 뜻인가요? 말그대로 효소 소화라는 뜻인가요? 효소를 어떻게 소화한다는 건인가요?   RNeasy mini kit을 사용하게 되어서 설명서를 읽는데 모르는단어를 구글링해봐도 안나와서 여쭙니다

안녕하세요 gDNA 추출을 하는데 농도가 너무 낮아서 질문 드립니다.  DNA 추출 키트로는 Promega의 Wizard Genomic DNA purification kit를 이용하였구요.  사용한 시료 샘플을 Bifidobacterium lactis랑 Bifidobacterium breve를 추출하고 싶은데 .. 농도가 너무 낮게 나와서요..  이전에 선배들이 해 놓으신 걸 보니  300ng/ul 이상은 나오는 거 같던데요..  제가 농도를 제니깐,,,, 턱도 없이 낮은 5ng/ul, 7ng/ul, 10ng/ul 정도 밖에 안 나오더라구요... 왜 이런지 아실까요??  protocol은 사용하는 kit 회사에서 다운 받아서 그대로 했습니다. ...  샘플 1ml (균 전배양액)을 이용해서 했는데...  어떤 부분이 혹시 잘 못 되었을 까요?? ㅠㅠㅠ  

DNA extraction 관련 실험을 하다가 궁금한 점이 생겨 글 남깁니다ㅠㅠ 제가 하고 있는 실험은 피나 세포주에서 DNA를 뽑아 이것을 특정 프라이머를 사용해 증폭시켜 플라스미드 벡터에 gene cloning 시켜 cell에 transfection  시키는 실험입니다. 실험 관련해서는 아니고 아주 기초적인 지식 같은데 검색해도 명확한 답을 얻지 못해 이렇게 질문 남깁니다.   1.  보통 DNA는 뉴클레오좀(히스톤단백질 등..)으로 이루어져 있거나 메틸레이션 된 부분도 있는 것으로 압니다.                                                        만약 피나 세포주에서 추출한 DNA에서도 이러한 뉴클레오좀 상태나 메틸레이션 된 부분이 그대로 추출되는지 궁금합니다.   2.  PCR로 증폭 시킨 특정 DNA 부분이 이제 플라스미드 벡터로 들어가 cell에 transfection되는데 이 때에도 뉴클레오좀 상태로 있는지 아니면 오직 서열만 존재하는지 궁금해서 질문남깁니다.

Agarose gel을 만들 때 30분 이상 굳혀야 되는걸로 알고있는데 사용하는 agarose의 양에 따라 굳히는 시간도 달라지나요? 예를 들면 1%의 gel보다 3%의 gel을 만들 때 굳히는 시간이 더 길어야 한다 이런 식으로요  

분변sample에서 추출 후 전기영동 사진 (gel 농도는 1%)입니다.   홈 바로아래에서 band가 선명하게 뜬 것을 확인하였습니다. 이전 실험에서도 동일한 pattern이 나온 것으로 확인하였습니다.   이게 어떤 것이라고 말할 수 있을까요? 대장균의 것인지 아니면.. 컨텀일까요?

제한효소로 자른 후에 gel purification하고, 시약 프로토콜대로 37도에서 30분간 CIP처리했습니다. PCR purification kit로 inactivation한 후 -20도 보관했다가, 다음 날 오전에 전기영동 내려보니 밴드가 전혀 보이지 않습니다. CIP inactivation이 제대로 되지 않아서 그런걸까요?

site-directed mutagenesis를 처음 공부하면서 실험을 하려고 하는 대학원생입니다.   제가 지금 하고자 하는 것이 플라스미드 벡터안에 있는 GGG  서열을 TGT 부분으로 바꾸려고 합니다. <기존 서열> ..........CCTACACGCACACACACGGGCGCGCGGGCGCGCACGCACA .........   <원하는 서열> ..........CCTACACGCACACACACTGTCGCGCGGGCGCGCACGCACA............   그래서 프라이머 디자인을 이렇게 짜 보았습니다.            S:  5’   C ACG CAC ACA CAC TGT CGC GCG GGC GCG C      3’           AS:  5’   G CGC GCC CGC GCG ACA GTG TGT GTG CGT G      3’ Tm 값을 0.41 X 73 - 675/L + 81.5로 이렇게 계산하니까 89.49가 나오더라구요 GC content는 76% 입니다.   1. Tm 값이 78이상이긴 한데 GC서열이 너무 많아서 이렇게 프라이머를 짜도 과연 괜찮을지 의문이 들었습니다.   2. 그리고 1번의 질문과 상관없이 하나의 돌연변이 말고 2개씩 이렇게 mutagenesis 시켜도 가능한지 묻고싶습니다.   3. 그리고 혹시 site directed mutagenesis로 이 서열을 mutation 시키기 어렵다면 혹시 다른 실험으로 mutation 시키는 방법이 있는지 알고싶습니다.  

안녕하세요! 이제 막 석사과정을 하고있는 대학원생입니다 제가 site directed mutagenesis 관련 실험을 진행하고 싶어 검색하던 도중 프라이머 디자인을 할 때, 프라이머 양 끝에 하나 이상의 G,C 서열이 포함되어야 한다고 나와있더라구요!   1. 꼭 이렇게 디자인을 해야하는지??  2. 그리고 꼭 이렇게 디자인 해야한다면 양 끝에 G,C 서열이 포함되어야 하는 이유는 무엇인지 궁금합니다!   혹시 알고 계신 분들 많은 도움 부탁드립니다 ㅠㅠ

  위 사진은 PCR Product를 적정 밝기로 찍은 것이고 아래 사진은 최대 밝기로 찍은 사진입니다.   gel extraction 까지는 할 필요 없고 purification만 해서 sequecing 맡길까 합니다.. 괜찮을까요?   그리고 제가 알고 있기론 gel extraction의 경우 멀티밴드가 떴을 때 수행하는 것이라고 알고 있는데, 제 전기영동상 최대밝기로 했을 때 미세하게 잡밴드가 뜨긴 했습니다. 어느정도 밝기? 였을 때 gel extraction을 해야하는지 궁금합니다.

          최종적으로는 sequencing을 위한 목적으로 합니다.    가장 밝은밝기로 찍었습니다, gel extraction 이후에도 double band가 확인되면 다시 한번 gel extraction을 수행해야 할까요? 한번더 수행하게 되면 수득률과 관련하여 문제가 생길까봐 머뭇거리게되는데,(Sample도 많지 않습니다.) 혹은, 해당 product를 다시한번 PCR해서 Gel extraction을 수행해야하는지요?   추가적으로 확인된 밴드가 얻고자하는 밴드보다 크기가 큽니다.   어떻게 해결하면 좋을까요..?

안녕하세요 저희는 Qiagen 사 Kit를 사용하여 조직에서 DNA를 Extraction하고 있습니다.   1. Extraction 이후 4도 냉장고에서 보관했을 때  얼마나 보관이 되는지 궁금합니다.   2. 추가로, PCR product도 어느정도 보관이 가능한지 두달정도 4도에서 보관한 product를 sequence를 맡길 경우, 괜찮은것이지?   감사합니다.

안녕하세요. 제가 cloning을 진행했는데,  agarose gel상의 insert size의 band를  UV로 확인하여 자른 후에 gel purification을 진행한다음, T4 ligation 후 DH5a에 transformation한 후 나온 colony들을 culture후 enzyme cut을 진행했습니다. 근데 gel elution을 하여 얻은 insert의 크기가 이전과 동일해야 하는데, shift된 형태로 커져서 나옵니다. 제가 gel purification 때 vector가 insert랑 같이 딸려왔나 싶었지만, insert와 vector의 항생제가 다르기 때문에 그럴 경우가 없다고 판단이 되었고, 혹시나 vector에 사용한 엔자임이 겹친건가 싶어 확인해보았지만 그것도 아니였습니다. 혹시 band shift 현상이 일어나는 이유가 무엇인지 아시는 선생님이 계시면 알려주신다면 감사드리겠습니다. *원래 나와야하는 insert size는 1890bp입니다.   감사합니다.  

    예를 들어 10% 농도의 샘플을 1%로 희석한다면 샘플 100ul + DW 900ul를 하면 1%가 되는데 5%에서 1%로 만들려면 어떻게 해야 할까요 ?

안녕하세요 현재 qiagen midi prep 키트를 이용해서 실험을 하는데요, 저희 centrifuge가 침수가 돼서 일주일 이상은 사용이 불가능한 상태라 급한대로 50mL centri 되는 실험실께 여쭈어봤는데 거기는 최대 rcf가 3000g라고 하더라고요... qiagen 프로토콜 보면 18000에서 20000g까지 돌리는데 시간을 늘리면 괜찮을까요..? 얼마나 늘려야할까요..?

제가 스테비아 DNA를 뽑고있습니다.   현재 기본적인 프로토콜은 CTAB 추출법을 사용중인데요 스테비아 잎을 액체질소로 간다음 1.5ml 튜브에 시료를 100ul까지 채운다음 CTAB 500ul 와 2-mercapto 20ul 를 넣고  30분간 65도에서 인큐베이션 이후 Chrolo : iAA (24:1)을 CTAB과 동량 넣은다음 원심불리 후 상층액을 딴다음 IPA 0.7배 첨가 후 1시간 -20도 휴지 후 원심분리 후 75% Ethanol 세척한 다음 펠렛을 말리고 3차 멸균수 로 일루션 하고 있습니다.   문제가 되는게 펠렛이 갈색 빛을 띄는 경우가 있고 하얗거나 투명해도 멸균수로 일루션 할때 잘녹지 않습니다.  결과적으로 나노드랍 결과에서 260/230값이 0.8~1.0사이로 낮게 나오고 260/280은 1.8~2.0이 나오고 있습니다. 260/230값을 개선하고 싶어서 현재 버퍼양도 조정해 보고 PVP40도 사용해 보았는데 결과가 좋지 않습니다 개선할 다른 방법이 있을까요?

안녕하세요. DNA extraction 과정에 의문점이 들어 질문을 하게 되었습니다. DNA extraction 할 때 '~ul를 넣고 ~분 동안  ~rpm으로 원심분리한다' 라는 과정이 많은데요, 각 buffer들이나 시약들이 어떤 역할을 하는지는 명확하게 파악할 수 있는데, buffer의 양이나 원심분리 rpm이나 돌리는 시간이 어떤 의미를 가지는지 잘 모르겠습니다. 그냥 DNA 추출을 연구한 분들이 가장 효율적이고 추출이 잘 될 때의 양/시간/rpm을 찾은 것인가요? 뭔가 이것보다는 이러한 과정을 거치는 더 많은 의미나 이유를 가지고 있는 것 같아서 여기에 질문드립니다...