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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
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Q. NADPH를 사용하려는데 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt 사용해도 되나요?
이번에 GPx실험을 하려고 하는데, 사용되는 시약 중에 NADPH가 있더군요그래서 실험실에 구비가 되어있는지 찾아보니, 실험실에는nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt가 있는 것을 발견했습니다nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 까지는 NADP인데, 'H'가 없으니 불안합니다NADPH를 사용할 때 저걸 사용해도 되나요 아니면 NADPH 시약을 따로 판매를 하나요?
회원작성글 hkdjgost  |  2014.08.06
Q. GST pull down assay를 수행하고자 합니다..
Yeast two hybrid 방법을 통해서 스크리닝한 단백질들에 대해서 실제로 상호작용을 하는지GST fusion protein 과 His fusion protein 으로 발현시켜 GST pull down assay로 확인하고자 합니다.이쪽 실험이 처음이라 기초적인 질문이긴 합니다만..일단 각각의 fusion protein을 column을 통해서 GSH와 Ni-NTA로 정제하려고 하고있습니다.이후 정제된(elution한) 단백질들끼리 섞어 주면 되는건가요..?그런데 GST-GHS 결합때문에 dialysis 이런것도 필요하다고 하던데..dialysis 반응 이후에는 또 결합이 잘 안된다는 말도 있어서제생각에 GST-protein 정제과정 중 GSH가 있는 상태에서 정제한 His fusion protein 을 섞어 주어서(이때는 binding buffer가 따로 필요한가요?)이후에 뭔가 결합을 한다는 것을 확인 할 수 있는 방법이 있는지요..질문이 좀 두서없지만.. 전체적인 큰 과정이 잘 이해가 안돼서 그렇습니다.ㅠㅠ도와주세요
난징  |  2014.07.23
Q. IP 할때, sample buffer에 beta-ME 유무
  제가 지금 CO-IP를 진행하고 있는데요.. 궁금한 점이 있어 질문 올리게 되었습니다.   Interaction을 보고자 하는 단백질 A와 B의 크기가 각각 50Kb, 20Kb정도 되는데요.. 문제는 단백질 A의 크기가 heavy chain 사이즈와 겹쳐 정확한 사이즈를 확인할 수 없다는 겁니다.. 그 정도 크기는 gel 상에서 넓게 벌리는게 불가능하다보니.. ㅠㅠ   방법을 찾아보니까, light-specific antibody를 사용하거나 western시, sample buffer에 beta-ME를 빼고 끓이면 HC와 LC가 떨어지지 않아서 150~200Kb(?)부근에 밴드 하나만 나타난다고 하더라구요. 지금당장 항체를 구입할 수는 없을 것 같아 두번째 방법을 사용해보고 싶은데요.. 혹시 해보신분들 계신가요? test를 해보고싶긴한데.. 그냥 cell lysate에 IP에 사용하는 항체 넣어주고 gel 걸어서 western에 사용하는 항체로 detection 해보면 될지.. ^^;;;;;;;   다른 방법이 있다면 조언 부탁드립니다.. ㅠㅠ
학생  |  2014.07.04
Q. IP할때 endogenous한 단백질 양이 적을 경우
endogenous한 단백질 가지고 IP를 처음 진행하는데요, 만약에 세포 내에 존재하고 있는 단백질 양이 적으면임의로 overexpression 시켜줘도 되나요..? protein-protein interaction 보는거라 충분한 양이 있어야 IP가 더 잘될거 같아서요..;이럴 경우 세포의 phenotype이 바뀔까봐 조언을 얻고자 합니다. 적으면 적은 상태로 그냥 진행해도 되는건지..
학생  |  2014.06.24
Q. 인산화된 단백질도 co-ip를 할수 있나요?
transient transfection으로 CO-IP를 하려고 하는데phosphorylated protein 으로도 할 수 있나요?결국 이 단백질에 대한 plasmid를 만들어야한단 얘긴데.. 가능한가요? 가능하다면 방법이 어떻게 되는지 궁금합니다...
학생  |  2014.06.23
Q. pull down assay column 질문입니다.
pull down assay를 하려고 합니다.현재는 GST- A protein,  His-B protein 를 각각 정제하기 위해서 solubility 조건을 잡고 있는 중이고요궁금한 것은 pull down assay라고 찾아보면 pull down assay kit에 포함된 spin column들을 사용하는 것 같습니다.정제할때는 그냥 일반 polypropylene column을 사용하려고 하는데.pull down 시에는 사용하는 column이 다른것 인가요?좀.. 너무 기본적인 질문 인것 같지만.. 이런 내용은 나와있지 않아서 질문드립니다.
회원작성글 융융  |  2014.06.12
Q. alcohol dehydrogenase activity 측정 실험에 대해 질문 있습니다.
유산균을 이용해서 alclohol dehydrogenase activity를 측정하는 실험 중에 있습니다.저는 Nosova법을 참조해서 하고 있는데요.2.5mM NAD+, 0.1M glycine buffer, 22mM ethanol 과positive control로는 ADH, negative control 로는 0.1M glycine buffer, sample로는 유산균의 cytosol을 반응시켜서 OD값으로 assay를 진행 할 예정입니다.그런데 논문에위에 2.5mM NAD+, 0.1M glycine buffer, 22mM ethanol 의 몇 ml와 sample 몇 ml를 반응시켜야하는지는 안나와있어서 실험을 진행하지 못하고 있습니다.혹시 해보신 분들 계시다면 조언 부탁드립니다.그리고 그 전에 bradford로 정량을 해서 실험을 해야한다는데 그게 무슨 의미인지도 알려주시면 감사하겠습니다.
폴프랭크  |  2014.06.05
Q. Native PAGE을 통한 protein interaction 확인이 가능한가요
현재 단백질들 간의 상호작용을 보기위하여 해당 단백질들의 정제과정에 있습니다.궁금한 것은 정제 이후 실제 상호작용 한다는것을 실험적으로 증명하는 단계입니다.이론적으로만 알고있지만 가능한 방법으로는 1 . A, B 단백질을 각각 GST, His tag을 통해서 정제 한 후 이를 pull down assay 하는 방법2.  A, B 단백질을 His tag으로 정제하여 in vitro 에서 binding 한 후 Native PAGE 를 통해서    A, B A+B 3가지를 비교하여 binding을 확인하는 방법,기타 다른 방법들이 있지만.. 여건상 힘들것 같아서 위 두가지 실험에 대해서 생각하고있습니다.실제로 nativa page를 통해서 interaction한다는 것을 증명하여 논문에서도 자주 쓰는지요?아니면 일반적으로 pull down assay를 많이 하는 지요..또한 in vitro 조건에서 단백질끼리 binding 해보신 분이 있다면 과정이나 변수정도는 어렵지 않은건가요..?실험실에 물어볼수 있는 사람은 없고 시간도 없어서.. 답답한 마음에 질문드립니다.도와주세요!
대학원생  |  2014.05.27
Q. GST pull down assay
GST pull down assay를 수행하고자 합니다.처음 해보는 실험이라 질문 남깁니다.GST-fusion protein은 glutathione sepharose 4B bead를 통해 얻어 elution 하였습니다.elution buffer에는 reduced glutathione이 포함되어 있구요~elution 이후, dialysis하지 않았습니다.아무튼 특정 protein과 interaction 할거라고 예상되는 cell lysate에 GST-fusion protein을 섞은 다음, 다시 glutathione sepharose 4B bead를 넣어서 pull down를 하고, 특정 protein의antibody를 붙일 생각을 하고 있습니다..위와 같은 실험을 할 경우, dialysis과정은 필수 인가요? 아니면 하지 않아도 되나요?제가 이질문을 하는 이유는 reduced glutathione으로 elution을 하게 되면, 다시 glutathione에 붙지 않는 다는 얘기를 들었기 때문입니다. 하지만,, 이사실을 모르고 test를 해보았는데...glutathione sepharose 4B bead로 pulldown을 해본 결과, GST or GST fusion protein은 pull-down은 되더라구요.....뭐가 맞는 것지 잘 모르겠습니다..실험을 잘못한건지....특정 사람의 얘기가 틀린건지...선배님들의 조언 부탁드리겠습니다.^^
회원작성글 궁금이  |  2014.05.25
Q. protein-lipid 결합체 농축하는 방법
안녕하세요~실험 중 풀리지 않는 의문에 이렇게 글을 씁니다.저는 protein-lipid 결합물질(EDTA 시료에 있음)을 농축하고자 하여, 어떠한 방법을 써야할지 의견 나누고 싶습니다.우선, protein 같은 경우, amicon tube나 동결건조 후 western을 하면 문제없이 농축된 것을 볼 수 있었습니다. 그런데 lipid도 함께 보고자 할 때, 위 시료를 동결건조 하면 protein-lipid 결합체가 안정한가요~?선임 연구자들의 의견 듣고 싶습니다.감사합니다.
귀염두이  |  2014.05.13
Q. IP후에 IB 질문입니다.
  논문을 읽는데 이해가 되질 않아서요 IP해서 A단백질을 분리해냈고 p-tyr antibody로 immunoblotting을 한 결과인데B, C, D 왜이렇게 많이 밴드가 나오죠?그럼 두번째 lane 같은 경우엔  B,C,D 단백질이 모두 phosphorylation이 일어났고, A와 반응한다고 해석해야 하나요? 어렵네요.. ㅠ
hw3  |  2014.04.28
Q. IP 하는 중에 1차항체를 너무 많이 넣었는데요..ㅠㅠ
지금 IP를 하고 있는데요,1차 항체를 1ug 만 넣어준다는 것이,실수로 5ug를 넣어버렸는데요.. 아직 하는 중이라 결과가 어떻게 나올지는 모르겠지만이런 경우, 어떤 결과를 예상할 수 있나요..?bead가 여분의 항체까지 다 잡아버리면 western 했을때 밴드가 지저분하게 나올거 같은데.. 어렵게 모은 샘플이라 불안해서 질문 올립니다.. ㅠㅠ
학생  |  2014.04.09
Q. IP과정중에 이상한 일이 벌어집니다...
IP를 주로 하고있는 석사과정생입니다.다름이 아니라 GFP와 FLAG을 이용해서 IP를 진행하고있는데,GFP-only + FLAG-특정단백질 을 293T에 co-transfection 시킨후GFP ab로 IP를 하고, FLAG으로 coIP된 band를 보면GFP와는 binding 할수가 없는데도 FLAG에서 해당되는 단백질의 band가 나옵니다...제가 추측하기로는(1) GFP항체가 문제가 있을것이다?(2) overexpression이 너무 많아서 단백질이 너무 과도하다?(3) protein A bead 자체에 단백질이 결합을 한다?(4) FLAG-단백질 이 단백질이 특이한 현상으로 GFP와 결합되어 나온 현상이다?위와같은 추측들을 해보았는데...실험적인 방법에서는 다른 IP실험에서는 정상적으로 되어왔기때문에 실험적인 방법이나 스텝에는 문제가 없을거라고 생각합니다...혹시 비슷한 경험이 있으신분은 도움 부탁드립니다 감사합니다.
회원작성글 생물학석박과정  |  2014.03.20
Q. 혈액 또는 조직(간)에서 sod, catalase, GSH-peroxidase를 매뉴얼로 측정하려고합니다.
혈액 또는 조직(간)에서 sod, catalase, GSH-peroxidase를 매뉴얼로 측정하려고합니다.매뉴얼로 측정하되 샘플수가 많아서 큐벳이 아닌 96well plate를 사용해서 측정하려고 하는데요프로토콜있으신 분은 알려주세요~  논문을 찾아봐도 kit으로 측정한것은 많은데 매뉴얼로 한것은 별로 없고 무슨 말인지 잘 모르겠네요... ㅜㅜ
궁금이  |  2014.03.19
Q. surface biotinylation후 lysis buffer
surface biotinylation후, triton x-100 1% 들어있는 lysis buffer로 진행 하였는데, avidin pull down fraction에서 biotinylated target protein이 너무 약해서, Plasma membrane solubilization이 덜 된건가 싶어, lysis buffer를 바꿔보고자 합니다. RIPA buffer들을 사용한 논문을 봤는데, 이론적으로는 문제가 없는 것으로 찾아 보았으나, RIPA BUFFER 는 biotin-amine 같의 결합 및 avidin간의 결합에는 영향을 주지 않는지요?
sgta  |  2014.03.19
Q. glutathione 과 SDS-PAGE문의입니다.ㅠㅠ
안녕하세요 석사 새내기 입니다....ㅠㅠ제가 지금 GSH와 어떤 protein으로 invitro 상태에서 binding을 볼려고 IP를 준비하는데요이 물질2개를 반응시켜 SDS-PAGE gel로 확인하려 합니다.물론 B-mercaptoethanol은 빼구요.그런데 SDS를 넣어줘도 GSH가 protein에 떨어지지는 않나요?생각해보면 떨어질것 같기도 아닐것 같기도 하구요....ㅠㅠ찾아봐도 나오지 않아 이렇게 문의드립니다.고수님의 친절한 답변 기다리겠습니다.읽어주셔서 감사합니다. 
김만식  |  2014.03.17
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