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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunoprecipitation
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Q. co-immunoprecipitation
rat 조직에서 phosphoprotein과 kinase의 interaction을 co-ip로 보려고 합니다.ip를 phosphoprotein으로 했고, WB을 kinase로 했습니다. WB할때 loadying control을 IP했던 phosphoprotein으로 했는데,band의 양이 일정하게 나오지 않았습니다.extraction 후에 정량해서 ip할때는 같은 양으로 했는데,왜 그런건가요? 일정하게 맞추려면 어떻게 해야 할까요?ip할때 total 양이 50ul 정도 되는데, 양이 적어서 충분하게 골고루 반응이 안되서 그런걸까요?
가나다라  |  2011.04.21
Q. streptavidin bead로 추출을 하는 원리를 알고 싶습니다.
streptavidin이 biotin과 매우 강한 결합을 하느느것으로 알고 있는데요,제가 하려는 실험이 streptavidin에 상보적인 서열을 가진 rna결합한 물질을 분리하는 거거든요그 물질은 straptavidin과 결합이 될텐데, 문제는 그러고 어떤식으로 분리가 되는건지 알수가 없네요. bead제품 글들을 구글링 해보니 biotin을 이용하여 침강(precipitation)시킨다는 말이 있던데, immunoprecipitation과 비슷한 원리로 분리 시키는건가요
회원작성글 식당  |  2011.04.15
Q. Fc antibody로 IP 하는데.. antibody 없이 가능할까요?
IP를 위해 prep한 cell lysate에Fc가 붙은 protein을 넣어준 후 interaction 시킨 후이 protein과 interaction하는 것들을 잡으려고 하는데요...protein A/G agarose의 경우 Fc부분에 binding하니까..bead로 protein-fc + 다른 것들 complex를 IP하는 것이 가능할까요?Fc antibody 없이 bead만 가지고 IP 하는 것이 될까요?
궁금  |  2011.04.11
Q. EtBr....
논문을 읽다가 궁금한 점이 있어서 지식이 많은 여러분들께 여쭤보려고 합니다. IP를 할때 EtBr을 왜 넣는지요??논문 텍스트에 보면 presence of ethidium bromide demonstrated that the co-immunoprecipitation between A and B did not depend on the contaminating DNA라고 적혀져있는데 이 말의 의미를 잘 모르겠습니다. 도와주세요.ㅠㅠ
우힝힝  |  2011.03.09
Q. agrose bead
immunoprecipitation 시에 주로 어디 회사의 agrose  bead를 많이 쓰시나요?잘 되는 회사의 제품을 추천해주세요저는 santa 제품을 사용했습니다
ip  |  2011.02.28
Q. co-immunoprecipitation 에 대한 질문입니다..
co-ip할때 IP 와 IB할때 같은 Host 꺼 쓰면  왜 안되나요??원리를 가르쳐주세요...^^
ㅎㅎㅎ  |  2011.01.19
Q. co-transfection시킨 후 발현량의 감소?
Co-IP 실험을 하고 있습니다. 서로 다른 plasmid (A, B, C)를 가지고 단백질 A에 대한 B 또는 C 단백질의 결합정도를 비교하고자 두 가지 조합으로 (하나는 A와 B, 또 하나는 A와 C)두 가지 plasmid를 같이 transfection시켰습니다. 그리고 A, B, C를 각각 single  transfection서 IP를 하려고 하기 전에 발현량 정도 (input)를 비교하였는데 이상한 점 있습니다.  먼저 궁금한 것은 input량의 비교했을 경우 A, B, C의 single transfection의 경우는 어느 정도 발현이 됨을 확인하였으나 A와 B, A와 C 처럼 co-tranfection시켰을 경우는 A는 발현이 잘 되나 B와 C의 경우는  거의 발현이 되지 않습니다. 왜 single transfection때는 발현이 잘 되는 것이 cotransfection때는 발현이 되지 않을까요?제 생각으로는 A에 대한 B 또는 C의 결합정도를 비교하고자 하는 것이라면 A, B, C 모두 발현이 되고, 특히 cotransfection시켰을 경우 B와 C의 발현량이 거의 동일한 상태에서 A에 대한 B또는 C의 IP band 비교가 되어야할 것 같은데.... 제 생각이 맞다면 어떻게 문제를 해결하면 될까요?1) DNA quality가 의심되어 quiagen의 maxi prep kit를 이용하여 다시  prep하였습니다.2) Lipofectamine 2000을 사용하고 있는데 lipofectamine의 양을 권장하는 DNA:reagent ratio (1:2 or 1:3) 대로 따랐습니다.3) 혹시 A가 B또는 C의 발현량을 조절하는 것일까요? A, B, C 모두 transmembrane protein이라 그럴 가능성은 낮을 것 같은데요. 이럴 경우 binding 정도 비교가 힘드나요?충븐히 설명 되었는지 모르겠네요.부족한 저에게 조언 부탁합니다.
도전  |  2010.12.04
Q. rat brain에서 A와 B의 endogenous co-IP 실험에 대한 질문입니다
rat brain extract를 추출하여,제가 보고자 하는 A와 B protein의 endogenous한 co-IP를 실험하려고 합니다.한번도 해본 적도 없고 정보도 별로 없을 뿐더러 이해도 잘 되지 않아, 이렇게 글을 씁니다.질문은 크게 몇가지가 있습니다.1. rat을 주문한 이후부터 실험 방법을 알고 싶습니다.2. perfusion을 하지 않고도 가능한가요?실험해보신 선배님들 부탁드립니다. ^^감사합니다.
회원작성글 softcho  |  2010.12.01
Q. immunoprecipitation (IP)
제가 A라는 protein을 두가지 ab 를 이용해서 IP 해서  interaction 하는 protein 들을idenify 하는 실험을 수행하려고 하는데요.일단 문제는 첫 번째 IP 수행후 protein A/G agarose bead 를 이용해서 pulldown을 수행하고bead에 붙은 proein-ab complex를 어떻게 elution 해서 두번째 IP 를 수행하느냐 입니다.찾아보니 glycine gradient로 하는방법도 있는 것 같긴 한데, 물론 이것도 조건을 잡아야 겠지만일반적으로 쓰이는 elution buffer 조건과 방법이 궁금합니다  
회원작성글 김기범  |  2010.11.25
Q. co-IP를 하고 있는데요....
GFP-tagging된 protein을 igg에 GFP antibody 가 bead에 붙은걸 사용해서 co-immunoprecipitation을 하고 있는데요.elution할때 Urea를 사용해서 하고 있는데 protein의 양이 매우 적네요...다른 좋은 방법없을까요?(참고로 SDS나 Triton X-100같은 degergent사용하는 방법은 제외하구요.끓이지 않는 쪽으로 생각중입니다. elution한거 MS로 찍어봐야 해서요.)아시는분 좀 알려주세요...
회원작성글 해바라기  |  2010.11.02
Q. IP실험시 input 양을 종잡을 수가 없네요..
IP실험을 하고 있는데 input의 양은 얼마를 loading 해야할지 모르겠습니다.IP에 125ug 사용하고, input에 25ug 사용했는데 (output의 1/5)input band가 아예 보이지 않습니다. 양이 너무 작은가요?...output에서는 band가 잘 보이는데 말이죠...agarose A regin의 IP ability에 따라 output band보고서... input 양 잡을 수 있다는데혹시 Thermo Pierce protein A agarose 로 IP 해보신 분 있으시면팁 좀 주세요,,
궁금  |  2010.10.29
Q. 혹시 HEK293 cell 분양해 주실수 있으신 분 없으신가요?
안녕하세요? co-IP를 하려고 mamalian cell 중 HEK 293이라는 녀석이 필요한데 혹시 가지고 계신분 있으시나요?식물분야만 실험을 했던터라 mamalian cell은 가지고 있는게 없네요...부탁드립니다.제 메일 주소는 tsmj11@gmail.com 입니다.
대학원생  |  2010.10.19
Q. Co-IP for protein complex
Co-IP를 하고 있는데 궁금한게 있어서 이렇게 글을 올립니다. 일반적으로 Co-IP 하면 두 개의 단백질의 상호작용을 확인하는데 쓰이는 방법으로 알고 있는데, 3개의 proteins 도 가능한가요 ? 예를들어 A-flag, B-myc, C-myc. A를 flag 으로 IP 시킨 후 myc Ab's 를 사용해서 두개의 protein을 detection 할 수 있을까요 ? 이론적으로 보면 가능할 것 같은데...제가 지금 Co-IP를 이용해서 protein complex를 알아 볼려고 하거든요...많은 답변 부탁드리겠습니다.
Worrywart  |  2010.10.08
Q. Co-IP가 잘 안됩니다. ㅠㅠ
co-IP를 진행하고 있는데요. Flag으로 tagging된 단백질에 interaction partner (A)를 잡기 위한 co-IP를 진행하고 있습니다.얼마전부터 갑자기 Flag으로 IP를 하고 WB으로 A를 확인하면 전혀 signal이 보이지 않습니다.(예전에는 동일 조건으로 했을 때 signal이 선명하게 잘 보였거든요.)1. DNA construct의 문제  --> 새로 prep을 함.2. Transfection효율 --> 단백질 과발현 됨.3. IP --> 시작 lysate 양은 800~1000 ug으로 시작함. Anti-flag agarose gel을 사용.               반응시간 O/N4. Washing condition --> 0.1% TritoX-100이 포함된 TBS로 3번,                              혹은 detergent 없이 TBS로 3번5. Elution condition --> 3xFlag peptide로 elution(50 uL, 제품시트지상에는 100 uL 추천)                            또는 2x sample buffer (20 uL) 6. Antibody 상태 --> positive control로 확인 7. WB --> positive sample로 확인8. 실험실 온도 (여름) --> ice에서 진행예전에는 non-specific하게 binding한 A까지도 보여서 washing condition을 다시 잡아서 IP조건을 다 잡았다고 생각했는데,, 몇달전 부터는 IP후에 WB을 하면 Anti-flag으로 IP한 게 확인은 되는데, Co-IP가 되어야 할 A 단백질은 오고간데 없이 전혀 보이지 않는 겁니다. 어떤 부분에서 잘못된 것일까요? 고수님들의 조언을 기다립니다.   
밀크요팡  |  2010.08.27
Q. Co-IP 시 PMSF 역할
IP 실험을 하는 학생입니다.실험중 궁금한것이 생겨서 이렇게 질문드립니다.Protein A bead를 이용하여 IP 실험을 하고 있는데 IP 반응액에 PMSF를 넣어주고 안넣어주고에 따라서 최종적으로 elution 했을시밴드 패턴이 상당히 다르게 나타납니다.PMSF가 포함되어있는 경우 어느정도 specific한 결과가 나오는 반면PMSF가 포함되지 않은 상태에서 반응을 시켰을경우 non-specific한 밴드가 굉장히 많이 걸러져 나옵니다.PMSF가 protease inhibitor로서 작용하는것은 알고있는데위의 결과를 보고는 PMSF가 protease로 작용을 했다고 하기에는 결과를 설명할수 없는것 같습니다. 뭔가 다른 역할을 하고 있는것 같습니다. 어떤 역할을 하기에 이런 결과가 나왔는지 아시는분 설명 부탁드립니다.
석사  |  2010.08.26
Q. chromatin ip할 때 HA-tag antibody
mammalian cell에서 chromatin ip 할 때 잘되는HA-antibody 좋은거 아시면 알려주세요
soso  |  2010.08.16
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