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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunocytochemistry
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Q. ETBR로 Immunocytochemistry 하려고 하는데 protocol 검색이 잘 안되네요.. 혹시 아시는분?
단백질 aggregation 내에 DNA가 존재하는 것 같아 immunocytochemistry로 확인하고 싶어요.그래서 ETBR로 ICC하면 일반적인 red파장에서 볼 수 있다는 얘길르 들어서protocol을 찾아보았는데죄다 Agarose gel 예기뿐.. 혹시 ETBR로 ICC하는 방법 아시는 고수님 계신가요? 계시면 방법좀 알려주세요~ 부탁드려요g
ETBRICC  |  2013.11.29
Q. IFN를 제외한 면역증강 실험
안녕하십니까 저는 면역증강분야를 공부하고 있는 석사생입니다.제가 맡은 샘플을 실험하던중 의문점이 생겨 이렇게 글을 올려 도움을 요청하고자 합니다. Cell 은 raw cell을 사용하였구요, NO 와 cell viability를 보기위해 실험을 하엿습니다. 그런데 IFN과 제 샘플을 같이 처리하였을때와 샘플만 처리한 단독군의 수치가 동일하게 나왔습니다.해서 굳이 IFN을 처리하지 않아도 되는가 싶었습니다. 면역실험에서는 기본적으로 cell의 activation을 위해 IFN을 처리하는데저처럼 이런 경우에는 IFN을 처리하지 않아도 실험에 무리가 없는지,IFN을 꼭 사용하여 면역실험을 해야한다면 단독군이 왜 튀는지  알고싶습니다. 많은 코멘트들 꼭 부탁드립니다.
이슬기  |  2013.09.30
Q. Immunocytochemistry 용 PSD-95 antibody
cultured neuron에서 PSD-95 staining을 하려고 합니다. abcam, Synaptic sy 등을 이용했을 때 좋은결과를 얻지 못해서 다른 제조사 antibody를 알아보고있습니다. 추천 부탁드립니다.
PSD-95  |  2013.09.25
Q. Immunocytochemistry
Immunocytochemistry를 해보려구 하는데요. 맨 끝과정에 mount라고 있던데..정확히 몬질 모르겟어요...설명좀 부탁드려요
학생  |  2013.08.21
Q. IHC시 슬라이드 건조 조건
IHC를 수행하고 있는 연구원입니다. 전에는 paraffin으로 하다가 최근에 cryostat이 들어와서 frozen section을 하는데요..정말 힘듭니다.. 조직이 자꾸 망가지네요.. 제 생각엔 슬라이드를 말리는 과정에서 조직이 망가지는 것 같아서요...섹션까지는 별 무리가 없는 것 같은데 슬라이드에 조직이 잘 붙게 하기 위해서 파라핀 때 처럼 38도 hot plate에 올려서 말립니다.(30분에서 1시간 가량) 그 다음에 PBS에 담가서 OCT를 제거하고 슬라이드에 조직만 남게 한다음 ..면역반응을 수행을 합니다. 그런데 면역반응이 일어나고 안일어나고는 차치하더라도 조직이 너무 심하게 자꾸 망가져서요..처음엔 조직이 큼직한 구멍이 있는 것 같더니 요새는 조직 자체가 심하게 망가져있네요..중간 과정에서 조직이 부분적으로 마르는 경우가 있기는 한데...실험할 때 슬라이드가 한 번 물에 젖고 나면 다시는 말리면 안되는지도 알고 싶습니다. 항체 반응 하기 전에는 말려도 상관 없다고 들었던 것 같은데 , 제 생각엔 자꾸 말렸다 젖었다 그러면 조직이 상할 것 같아서요.. 글고 저는 차가운 aceton이나 methanol  에 슬라이드를 고정을 안했는데.. 그거 왜 하는 건가요?  어차피 조직은 샘플링할 때 4% PFA에 고정을 해야 하는데 굳이 슬라이드를 또 고정하는 이유는 먼가요?참 그리고.. 저는 주로 BSA로 blocking solution과 antibody dilution buffer를 만들어 써 왔는데..normal serum을 쓰는 게 좋다고 하더라구요..그럼 normal serum은 2차 antibody의 host와 같은 걸 써야 하는 건가요? 아니면 2차 항체의 target이 아닌 것이라면 아무거나 써도 되나요?(물론 cross reactive가 있는 것 끼리는 피하구요.)
stainer  |  2013.08.12
Q. pig embryo에서 ICC가 잘 안됩니다.
제가 돼지 난자에서 ICC 를 하고 있는 학생인데요.결과가 잘 안나와서요.. 저의 실험에 문제점을 잘 모르겠어서한번 봐주세요.1. Fixation : 4% PFA , RT 20min2. Washing : 0.1% PVA+PBS 3times, 10min3. Permeabilization : 0.5% Triton-X + PBS, 39'C 20min4. Washing : 0.5% Triton-X + 0.5%BSA + PBS 3times5. DNA denaturation (1st Ab: 5mC) : 4N HCl, RT 30min 이 과정은 안티바디 특성상 꼭 필요하기 때문에 HCl  처리를 함6. Blocking : 1% BSA + PBS, 39'C 1h7. Waching : 0.5% Triton-X + 0.5%BSA + PBS 3times8. 1st Ab 4'C overnightt9. Blocking : 1% BSA + PBS, 39'C 1h10. 2nd Ab 39'C 1h11. Washing : 0.1% PVA+PBS 3times, 10min이렇게 하고 mounting 을 하는데 나중에 형광을 확인해보면 전혀 detection이 되지 않아요.. 이 프로토콜로 원래 잘됐었는데 안티바디도 원래 쓰던걸로 새로 주문했는데왜 염색이 안되는지 궁금합니다..ICC 많이 해본 분들 도움좀 주세요 ㅜㅜ
교활한아이  |  2013.08.01
Q. IHC - cryosection 을 Stain과정에대한 질문
프로토콜이 있지만 영어가 약한지라 잘모르겠는데다 실험에 앞서 알고싶은것이 있어 검색해본결과paraffin기준으로 작성된것이 대부분이라 cyosection 에 해당하는 stain을 모르겠더군요.paraffin과 cyosection의 stain과정이 다른것인지 궁금하고또 IHC과정중 cyosection기준의 stain과정을 알고싶습니다.한글로된 프로토콜이 존재했으면 좋으련만..IHC 경험자분들의 조언 부탁드립니다.
회원작성글 브릭매니아22  |  2013.07.30
Q. confocal image를찍고있습니다.
confocal image를 확인하고있습니다.그런데 sample을 만드는 방법이 두가지가 있더라구요하나는 MeOH로 고정하는방법과 나머지는 PFA로 고정하는 방법이있던데둘다 해본 결과 MeOH로 고정을 하면 signal이 엄청 강하게 찍히는 반면제가 antibody를 double stainning하는데 두개가 너무도 겹쳐지게 거의 똑같은 모양으로 발현하더라구요그리고 PFA로 고정하는 방법은 쫌 연하게 관찰 되는데여기서는 이 둘이 MeOH로 한것처럼 완벽히 일치하는 경향은 보이지 않았습니다......보려고하는 sample에 따라 방법을 골라야하는건가요??둘의 경향이 아예달라서 어떤방법으로 해야할지 모르겠습니다.흠.........참고로 MeOH로 고정했을때는 세포핵안에 Ab의 발현이 관찰되지않고 세포질쪽에서만 보였는데PFA로 고정했을때는 세포핵안에서 발현이 관찰되서 아예 다른 경향을 보입니다.어쩌면 좋죠 ?? ㅠ_ㅠ
도와죠요  |  2013.07.29
Q. confocal data질문입니다
DAPI염색하면 저렇게 핵이보이는데 핵속에 구멍뚫린것 같은부분이인이라고 하던데 저공간이 비어있는공간이아니라 인으로 차있는 부분인거죠????DNA가 없는 부분이라 DAPI가 염색이 안된것이라하는데확실하게 어떤 부분인지 몰라서요 혹시 아시는분 계신가요???아 사진은 구글검색해서 붙였습니다!아 그리구 저게 보이는 핵도있고 아닌핵도있는데 그건 세포분열주기와도 상관있는건가요~???감사합니당
콘포칼칼  |  2013.07.05
Q. Immunohistochemistry에서 다른 species의 primary Ab를 사용?
안녕하세요. 실험을 준비하는 도중 IHC에 대해 도움을 얻기 위해 글을 올려봅니다.1. mouse model에서 rhbdf2라는 protein에 대해 IHC를 시도하려고 합니다.2. 시약 회사들을 검색해보았을 때 mouse용 rhbdf2 antibody 를 구입할 수 있는 곳은 Santa cruz 밖에 없는 데 이 회사 제품의 경우 western blot 및 immunofluorescence만 가능한 antibody 입니다.(http://www.scbt.kr/datasheet-138585-rhbdl6-t-12-antibody.html)혹시나 해서 회사에 직접 문의를 해보아도 IHC는 적용이 불가능 하다고 합니다.현재 우리 실험실의 여건 상 IF를 시도하기는 어려운 상태입니다.3. 그 외 회사에서는 human용 rhbdf2 antibody가 검색됩니다. (e.g. NOVUS, http://www.novusbio.com/RHBDF2-Antibody_NBP1-82126.html?utm_source=exact%2Bantigen&utm_medium=referral&utm_campaign=product)human만 가능하고 mouse에는 적용하다는 문구가 없으나 species reactivity를 보면 "Human. Predicted cross-reactivity based on sequence identity: Mouse(86%), Rat(86%)." 라고 쓰여져 있어서 mouse에서도 어느 정도의 reactivity를 보여주는 것으로 판단됩니다.4. 우리 실험실의 여건 상 IHC를 시행해야 하는 데 위와 같이 회사에는 human용으로 표기되어 있는 antibody를 구입하여 IHC를 시도해봐도 괜찮을 까요?이러한 경험이 있으신 고수분들의 도움을 요청합니다.감사합니다.
회원작성글 SnowEd  |  2013.06.25
Q. 베타 아밀로이드 DAB Staining
Wistar Rat Frozen Sections 에서 Amyloid beta 를 관찰하고자 합니다. 1차 antibody 정보는 다음과 같습니다. ABBIOTEC (Cat. 253244)Rabbit Anti-Beta-Amyloid, aa 1-16 Polyclonal Antibody1:500 dilution 2차 antibody 정보는 다음과 같습니다. VECTOR (Cat. BA-1000)Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L)1:500 dilution VECTOR (Cat.PK-6100)VECTASTAIN ABC KitVECTOR (Cat.SK-4100)DAB SUBSTRATE KIT FOR PEROXIDASE다음과 같은 조건으로 DAB Staining 을 했는 데, 조직만 염색이 되고, 베타 아밀로이드는 발현되지 않습니다. 제 생각에는 베타 아밀로이드 침착이 없을 가능성 (positive control 사용 예정) 혹은실험 조건이 맞지 않아서 (제가 이 실험을 처음 해보는 중이라서 조건을 아직 잡지 못했습니다.)두가지 가능성을 생각해 보았는 데,혹시 베타 아밀로이드 DAB staining 혹은 immunofluoresence 하신분들의 조언과 정보 공유 부탁드리겠습니다.
Luke  |  2013.06.06
Q. plasmacytoid dendritic cell (pDC) 를 IHC 로 visualization 하는 방법
...가능할까요? single-stain 으로 사용할 적절한 Ab 가 있을지 고수님들의 의견 여쭙고자 합니다. IHC 를 시행하려 하는 조직은 Human bone marrow 입니다. 
IHCer  |  2013.06.05
Q. 면역 실험에서 UV-Killed, Heat-Killed 박테리아를 사용하는 이유를 알 수 있을까요?
곤충의 면역반응을 알아보는 실험에서 UV-killed, Heat-Killed 박테리아를 주입하여 면역에 관련이 있어보이는 효소의 양을 측정하는 실험을 진행하는데 UV나 Heat 처리한 박테리아를왜 사용하는지 잘 모르겠습니다...제가 알기론 UV,Heat 처리한 박테리아는 활성을 띠지못해 죽는것 아닌가요? 그런데 이런 박테리아를 주입해서 면역실험을 하는 이유를 알고싶습니다.아시는분들 답변 부탁드려요~
회원작성글 Hightop  |  2013.05.11
Q. marcrophage 구입할 수 있는 곳이 있나요?
안녕하세요?marcrophage로 실험을 하려고 하는데 이것을 cell line 처럼 구매할 수 있는 곳이 있나요?거래하시는 곳이 있으면 알려 주시면 감사하겠습니다.
최정일  |  2013.05.11
Q. NeuN 발음하는 법
Neuron 염색하는 NeuN이요..발음법이 어떻게 되나요...??뉸?
당황  |  2013.05.07
Q. ICC 확인실패> 샘플을 살려서 다시 염색할 수 있나요??
안녕하세요 ICC를 혼자서 처음 수행해봤는데,제가 2nd antibody를 잘못붙여서 염색이 되지 않았습니다.다른 스텝에 전혀 문제가 없을 경우에 이미 DAPI 처리한 sample을 다시 살려서 볼 수는 없을까요?마치 웨스턴에서 스트리핑하는것 처럼요..
ICC초보자  |  2013.04.28
Q. mounting 할때 기포가 너무 생깁니다. aqua mounting 질문
poly mount나 xylene에서는 굉장히꺠긋한 이미지를 볼수있지만. 특수염색후 예를들어 형광염색후 aqua mount로 했을경우 무슨이유인지 버블이 장난아니게 생깁니다. 마운팅 당시에는 꺠끗했다가 시간이 지나면 버블이 생겨서 판독하기도 어려운데요.이유가 머죠? merk 사를 쓰고있는데 마운팅 당시에는 괜찮다가 상온에서 그다음날 보면 눈에아주 자세히보면 버블이 보글보글 있어서 환장하겠네요 이유가 뭘까요? 참고로 trap staining을 하고있고 뼈조직 5마이크로 조직입니다.
회원작성글 초보  |  2013.03.29
Q. 골다공증 조직염색 질문입니다.
osteoblast를 조직상에서 관찰하고 싶습니다.trap같이 눈에 딱띄게 보이는 염색을 원하는데제가 찾아본바 ALP staining과 alzarin red s 가 있는걸로 알고있습니다.osteoblast의 면적 혹은 수를 측정하기 위해서 어설픈 염색보다는 trap같은 눈에 확 띄는 염색법이 어떤게 있는지알고싶습니다. 위 염색기법 둘다 cell에서는 kit로 팔고있는데 파라핀조직으로 볼려면 어떤 시약을 사야할지 막막합니다. 골다공증 실험실이아니라 조건을 잡고있습니다. osteoblast를 보통 어떤 염색으로 루틴하게 보는지 알고싶습니다. 자세한 답변 부탁드립니다.
회원작성글 초보  |  2013.03.07
Q. immunocytochemistry 할 때 non-specific signal..
안티바디를 안티바디 제작업체에 의뢰하여 만들어 진 것을 테스트 하고 있는 학생입니다. C-term과 N-term에 대한 레빗 안티바디를 얻어서 다양한 실험들을 진행하였습니다. 과발현 시스템에서C-term 에 대한 안티바디 : WB, IP 확인N-term 에 대한 안티바디 : WB, IF 확인 이렇게 C-term에 대한 안티바디는 WB, IP 모두 잘 되는 것으로 확인이 되었고 N-term에 대한 안티바디는 WB와 Immunocytochemistry만 되는 것을 확인했습니다. 문제는 C-term에 대한 안티바디로 Immunocytochemistry를 진행했을 때입니다. non-specific signal이 지금까지 이미징 해봤을 때 전혀 보지 못한.. 세포들이 붙어있는 커버슬립 바탕이 모래를 뿌린것처럼 뿌옇고 또한 뭔가 동그랗게 뭉쳐있는 동시에 세포들이 빛을 내는 것이 아니라 반대로 까맣게 그림자처럼 보입니다. 안티바디 타이터를 낮추어도 같은 현상이 나타납니다. 같이 제작하였던 안티바디를 이용한 실험과 세트로 같이 실험하고 있는데 C-term 안티바디를 사용했을 때 이런 현상이 나타납니다. 왜 이런 현상이 나타나는지 궁금합니다 ㅠㅠ 전문가님들 도와주세요..
실험하자  |  2013.02.06
Q. IHC 에서 HIER 관련 질문입니다
mouse 1' Ab 와 Dako envision kit 를 사용하여 IHC 시행하는 중입니다. 금일 bone marrow 에서 Anti-CXCR4 Ab 를 이용해서 IHC 를 시행하였는데 DAB stain 이 전혀 되지 않았습니다. false negative 로 판단하고 있습니다.1) Ag retrieval 은 microwave 사용하고 있습니다. citrate pH 6.0 사용하고, buffer 온도 92~95'c 정도로 15분 돌리고 있습니다. 온도가 너무 낮아 retrieval 이 잘 되지 않은 것일까요? boiling 에 의해서 검체가 떨어지는 것이 무서워 retrieval temperature 를 조금 낮추었는데 이것이 원인이 될 수 있을 지 궁금합니다.2) Dako envision kit(k5007) 이용하시는 분께 질문입니다. 설명서에서는 DAB 가 strong light 에 노출되게 하지 말라고 되어있던데 형광등 아래에서도 DAB 이 반응을 안할 수가 있을까요? 3) 2일 전 만든 DAB solution 을 사용하였는데 그것이 좀 걸립니다. false negative 의 원인이 될 수 있을까요?이 사태의 원인이 무엇일지..ㅠ 고수분들의 답변 부탁드립니다. 감사합니다.    
IHC...  |  2013.01.17
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