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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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Q. Transformation 후 mini-prep을 하면 DNA가 사라집니다.ㅠㅠ
제가 요즘 cloning을 하고 있는, restriction enzyme으로 2 cut 한 후 insert를 넣는 실험을 하고 있습니다.  그런데 문제는 Transformation을 하고 colony PCR로 확인하였을 땐 insert가 분명히 있는데 mini-prep으로 DNA를 뽑고 gel loading을 해보면 band가 아예 보이지 않습니다. 몇 번을 다시 반복해봐도 똑같은 결과가 생깁니다. 또한 insert를 집어넣은 샘플은 colony가 열 개 뜰까 말까입니다. Transformation 단계의 문제는 아닌 것 같은게 아무 처리 안 한 vector만 transformation 시키면 colony도 아주 잘 뜨고, mini-prep DNA 농도도 아주 높게 잘 뽑힙니다. 도대체 왜 이런 결과가 생기는 걸까요,,,,,?ㅠㅠ  
회원작성글 djm0000  |  2022.05.26
Q. transformation시 vector volume 5% 초과하면 안되는 이유
transformation 할때, vector 볼륨이 competent cell의 5%를 초과하면 안된다고 하는데,,, 제가 여기 저기 찾아봐도 '초과하면 안된다'만 나와있을뿐, '왜' 초과하면 안되는지는 안나와있네요ㅠㅠㅠ 혹시 왜 5%를 초과하면 안되는지.. 이 5%의 의미를 아시는 분 계신가요
회원작성글 앨  |  2022.05.24
Q. DNA 클로닝,, 콜로니가 아예 뜨질 않아요
인서트 PCR후 벡터,인서트 gel 내려서 위치 확인 후 진행합니다.   ligation이 문제일까요,, vector-only 와 ligation 한것 둘다 콜로니가 아예 하나도 뜨질 않아요.. 무엇이 문제일까요.. 저희 랩에서는  ligation을 vector : 2람다, insert : 13람다, T4 buffer : 4람다, T4 ligase : 1람다 넣고 총 20람다로 만들고 -> 4도씨에서 오버나잇 합니다. 그 뒤 컴셀 30람다에 라이게이션 10람다를 넣어서 transformation 진행하고 있는데, 그동안 트포 후 꽝인 친구들은 많았는데 이번에 진행하고 있는 아이는 벌써 3번째 트랜스포메이션인데 콜로니 자체가 뜨질 않아요..
회원작성글 룰루랄라라라  |  2022.05.22
Q. EGFP랑 antibiotics resistance gene이 같은 promoter에 있어도 되나요?
박사과정으로 현재 ipsc에 electropolation 해서 gene editing 중입니다. 그런데 제가 가지고 있는 plasmid dna에 EGFP와 antibiotics resistance gene이 PGK promoter 하나로 묶여있는데 transfection 할 때마다 EGFP가 너무 약하게 나옵니다. 그래서 혹시 같은 promoter에 있어서 그런데 아닐까 싶은데 선배님들은 어떻게 생각하시나요?
회원작성글 기웃기웃  |  2022.05.21
Q. Reverse transcription PCR 결과 입니다. 조언 부탁드립니다....
Reverse transcription-PCR 결과 사진입니다.     1.5 Kb single band가 떠야하는데 굉장히 희미하게 나오네요ㅜㅜ     [Reagent] Buffer : 2 dNTP : 1.6 Primer(10 pmole) : 1  / Tm : 54 ~ 55 *Template : 1 Taq(1 u) : 1 DW : 13.4 *Template 경우, 2 ug RNA로 cDNA를 만들었습니다. 합성된 cDNA를 1X라 했을때 (1/2) (10^-1) (10^-2) (10^-3) 으로 진행했습니다. [PCR condition] Temp / Time 94 / 10 94 / 1 52 / 1 74 / 2 94 / 10 1. 1.5 kb band를 확실히 확보하기 위해서 조건을 어떻게 바꾸면 좋을까요? 2. Gel에 밑에 있는 프라이머? 들은 왜 생기는거죠?? 안나타나게끔 하고 싶어요...!  
회원작성글 앨  |  2022.05.19
Q. 플라스미드 내 전사 방향성에 대해서
cas9, gRNA을 발현하려고 하는 플라스미드 내에서 전사 방향성이 어떨 때 더 좋은가요?   1) [cas9]<-promoter-  -promoter->[gRNA]   2) -promoter->[cas9]  -promoter->[gRNA]   논문을 찾아보았을땐 대부분 2와 같은 형태로 클로닝을 하더라고요 근데 2의 경우에는 전사 종결과정에 영향을 미치는 점이 생길 가능성이 있을 수도 있다고 생각됩니다 그래서 장단점이 궁금합니다
회원작성글 리효  |  2022.05.18
Q. cloning과정중 pcr
안녕하세요ㅜㅜㅜ실험을 진행중인 초보 학부연구생입니다.. 다름이 아니라 DH5a의 clpB DNA를 cloning과정 중 PCR을 진행하고 있습니다. 지금 2주정도 pcr하는데 밴드나 dimer 조차도 안나와서요ㅜㅜ고수님들 도와주세요.. pcr mixture은 D.W 36.5ml, dNTP 5ml, 10X buffer 5ml, forward primer 1ml, reverse primer 1ml, Taq polymerase 0.5ml, DNA 1ml 하여 총 50volume 으로 조성중입니다. primer Tm 값이 forward primer는 61.1, reverse primer는 59.3입니다. 총 clpB gene은540 bp 입니다. 그래서 PCR돌릴때  Initial denaturation step 94도에 5분 Denaturation 94도에 30초 Annealing 55.2 45초 Extension 72도 34초 Final extension 72도 5분 총 30cycle 을 돌립니다. Annealing값과 Extension값을 올리거나 내려도 아무것도 보이지 않습니다ㅜㅜㅜ어떻게 하는게 좋을까요,..진짜 너무 속상합니다ㅜㅜㅜ  
회원작성글 체리망규  |  2022.05.18
Q. SV40 ori 와 293 T cell의 관련성
안녕하세요, Molecular cloning을 새로 공부하는 입장에서 궁금한 점이 있어서 질문드립니다.  Lentivirus를 활용한 Molecular cloning 과정에서 293 T cell의 정확한 역할을 알고 계신 분이 있으실까요? 먼저, 제가 알기로는, Transfer vector / packaging vector, envelope vector를 co-transfection해서 viral production을 위한 packaging cell로의 역할을 한다고 알고 있습니다. 제가 궁금한 점은 293 T cell이 가지는 SV40 large t antigen의 역할입니다. SV40 ori를 가지는 plasmid를 복제할 수 있다고 하는데, 그렇다면 transfer vector에는 항상 SV40 ori를 가지게 만들어야 하는 것일까요? 아니면 SV large t antigen은 그냥 부가적인 역할인가요? (넣지 않아도 상관없을까요?) 제가 만들려는 vector는 E.coli ori를 가지게 만들어, E.coli에서 replicate한 후 transfection하는 과정을 거치려고 하는데, 이렇게 되면 293 T cell에서 SV40 large t antigen은 어떤 역할을 하는지, 역할을 하지 않아도 상관없는지 궁금합니다. 감사합니다!
회원작성글 민석장군  |  2022.05.17
Q. 작성자 요청에 의해 삭제된 게시물입니다.
작성자 요청에 의해 삭제된 게시물입니다.  
회원작성글 kjo  |  2022.05.16
Q. CMV promoter 에 있는 Tet operator
안녕하세요   Cas9 이용해서 Cloning design을 하던 중에 궁금증이 있어 질문드립니다.   제가 구상한 대로 깁슨을 하였고 이제 세포 실험에 활용하려던 찰나에 벡터맵을 자세히 보니 제가 놓친 부분이 있어서요   진핵세포에서 발현을 위해 CMV promoter를 사용하였고  이 그림과 같이 CMV promoter 뒷부분에 Cas9 이 전사되도록 디자인되어 있는데요  제가 사실 이 벡터를 아는 분께 받아서 사용하였는데 미처 Tet operator에 대한 것은 보지 못했습니다.   보시는 것처럼 Tet operator가 2개 반복되어 들어가 있는데요   제가 검색하여 찾아본 바로는 Tet repressor를 같이 준 경우에서 Doxycycline induce를 하게 되면 뒤에 있는 유전자가 전사되는 것으로 이해하였습니다. (그런데 이 경우에는 Tet operator가 꽤 여러개 반복된 경우더라구요)   제가 궁금한 점은 repressor를 따로 넣어주지 않고 저 벡터 상태로 예를 들어 HEK 293T cell에 transfection 시키면  따로 Doxy induce 없이 뒤에 있는 유전자인 Cas9이 전사되고 발현되는지가 궁금합니다.   너무 초보적인 질문이지만 답해주시면 감사하겠습니다.    
회원작성글 샤또  |  2022.05.15
Q. 제한효소 storage buffer
DNA와 vector를 자르기 위해 restriction enzyme을 사용했는데 이러한 restriction enzyme은 glycerol이 담긴 storage buffer에 담겨있다고 하더라구요 이 storage buffer에서 glycerol의 역할은 무엇인가요?
회원작성글 바이오팜  |  2022.05.10
Q. [Geneworking] RBS 어떻게 찾을 수 있을까요?
안녕하세요 연구실에서 진 웤을하고 있는 학생입니다.  유전자 발현을 위해서 꼭 필요한 요소 중 저의 vector 에서 Ribosome Binding Site 가 어디에 있는지 모르겠습니다. (gene map에 표기가 안되어있습니다) RBS 자리가 가시적으로 보이지 않으니 유전자를 자르고 붙이는 과정중에 떨어져 나갈 수 있는게 아닌가 싶어서 확인을 하고 싶은데 vector 들의 RBS 시퀀스 정보를 어디서 어떻게 찾아볼 수 있는지 궁금합니다. 
회원작성글 Sssun  |  2022.05.09
Q. liagtion 넣는 양 계산
liagtion 과정 중 헷갈려서 질문드립니다. Insert DNA 크기 4.1kb Insert 농도 111ng / ul Vector DNA 크기 5kb Vector DNA 농도 99ng /ul 인데 몰비를 I : V , 2:1로 하려합니다. 계산해보니 Insert를 162.9ng 을 넣으라하는데 양을 얼마나 넣어야 되는지 감이 안잡히네요 20ul 기준으로 하면 insert 랑 vector 양을 얼마나 넣어야 될까요?
회원작성글 Sns222  |  2022.05.09
Q. pGL4-luc 뜻
Promega luciferase vector 중 하나인 pGL vector의 'GL'이 무슨 뜻인지 data sheet를 봐도 안나와있던데 어디서 알 수 있을까요?? 혹시 알고 계신 분 있으신가요?
회원작성글 앨  |  2022.05.09
Q. Gene map 프로그램
gene map 그릴때 다들 보통 어떤 프로그램 이용하시나요?? 무료 프로그램 쓰시는 분 계신가요?? 추천해주세요..!!
회원작성글 앨  |  2022.05.06
Q. Plasmid Cloning 중 계속되는 mutation과 plasmid prep문제
안녕하세요. 5kb 정도의 gene을 lentiviral vector에 cloning하는 중에 계속해서 mutation이 생겨서 질문드립니다. 다른 gene들을 cloning할 때와 같은 PCR condition이라 PCR 도중에 생기는 에러는 아닌 것 같고요. 그래도 여러 콜로니를 스크린해서 클론을 얻는데 까지는 가는데 그 plasmid를 다시 이콜라이에 넣거나 처음에 만들어놓은 stock에서 다시 키워서 plasmid를 정제하면 DNA가 거의 나오지 않습니다. 이콜라이는 Stbl3를 사용하고 있습니다. 혹시 이렇게 까다로운 gene을 안정적이게 유지할 수 있는 균주가 있으면 추천부탁드려요.   감사합니다.
회원작성글 배불러  |  2022.05.04
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