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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > DNA Modification
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. Seq 결과상 Mutaion이 발결되었을 경우 표기방법
안녕하세요이번에 DNA를 뽑아서 PCR해서 Seq를 보내서 결과를 확인 했습니다결과상 270~273번 째에서 AAA ->GAA 로 mutaion이 발견되었는대표기 방법을 해서 보고 해야하는대trs G270A라고 해야하나요?
회원작성글 실험어렵다  |  2018.11.25
Q. NP40관련 질문입니다.
단백질 추출 시작시 사용한 NP40 buffer를 FASP처리를 위해 필터(마이크로콘-30)에 올리려고 합니다. NP40가 필터 구멍을 녹일수도 있다고 알고있는데 필터에 영향을 주지않는 max 농도는 얼마정도 되나요?
회원작성글 se0y0ung  |  2018.11.23
Q. phiC31 integrage 발현은 어떻게 확인하나요???
안녕하세요 실험실에서 열심히 실험을 하고있는 학부생입니다. DH5a에 pFC와 phiC31을 넣은 다음 integrage에 의해 pFC가 genomic DNA에 들어가는 실험을 하고있는데 integrage가 발현이 돼서 pFC가 들어갔는지를 확인하는 방법으로 PCR을 이용해서 하고있는데 발현이 안되고 있는거같아서 발현이 어떻게 되는지 방법이 따로 있는건가요???
회원작성글 머랭  |  2018.11.22
Q. lentiCRISPRv2를 이용해 Transfection을 하려고 합니다
Addgene에서 lentiCRISPRv2를 구입하였고 이를 이용해 lentiviral system을 사용하려고 했습니다.lentiCRISPRv2가 Cas9도 발현하고, sgRNA도 발현해서 이거대로만 만들면 됐었는데 중간에 헷갈려 기존에 있던 Addgene의 Cas9/sgRNA vector에 gRNA를 디자인하였고, ligation까지 끝냈습니다. 다시 lentiCRISPRv2를 디자인 하기엔 기다리는 시간이 오래걸려서 이대로HEK293T에 Transfection해볼까 하는데 lentiCRISPRv2와 Cas9/sgRNA vector를 co-transfection하면 lentiviral system이 될까요?? Cas9/sgRNA vector는 원래는 lenti system에 이용하는게 아니지만요,,또한가지의 질문은 HDR을 위해 lentiCRISPRv2에 sgRNA를 디자인하여 제대로된 vector를 만들고, HEK293T에 transfection 시킬때 ssODN를 함께 트펙시킬껀데 그냥 농도만 조절하고, transfection reagent만 넣어주면 되는건가요?? 찾아보니까 electroporation을 이용하는걸 많이 추천하시던데 굳이 그걸 이용하지 않아도 될까요?
회원작성글 돗토리묵  |  2018.11.20
Q. SAM-III Riboswitch sequence의 E.coli로의 transformation 과정 질문드립니다 첨부파일
학생 연구로 E.coli L-form의 recovery time을 비교하는 연구를 진행 중입니다.Riboswitch를 이용하여 가역적으로 target gene을 knockdown시켜서 L-form recovery time을조절하는 것을 목적으로 하고 있습니다.사용하려는 riboswitch는 첨부한 SAM-III riboswitch입니다. 그런데 제시된 sequence 중간에 빈칸이 있어서 빈칸은 어떻게 처리해야 하는지 궁금하고, 해당 첨부 파일에 총 16줄의 시퀀스가 적혀 있는데 어떤 것을 선택해야 하는지 잘 모르겠습니다.이 서열로 plasmid를 합성할 때, 빈칸은 어떻게 처리하며, 업체에 어떻게 서열을 보내야 하는지 알려주세요
회원작성글 배호연  |  2018.08.28
Q. nickase test 에 대해서 설명 부탁드립니다.
안녕하세요DEPC water 구매중에 성적서에서 Nickase test 통과되었다고 하는데Nickase test가 DEPC water랑 무슨 관련이 있어서 하는건가요?그리고 protocol을 알수 있을까요?구글링 해봐도 확인할 길이 없네요..ㅠ감사합니다
회원작성글 dbkorea  |  2018.06.04
Q. 겔 사이즈보는법!!밑에거랑달라욥 첨부파일
제한효소처리후인데 제가볼땐암만봐도 3000bp랑 1000-500bp사이 밴드같은데 pcr product1.5kb라하구 겔에서랑 pcr산물사이즈랑 무슨연관이있습니까??
회원작성글 망고맹고  |  2018.05.20
Q. DNA농도희석
100ul (1.79ug/ul) 의 표준균주를 희석을 시키려고하는데왜 177ul dw  에 2ul 이렇게 희석을 할까요..? 몇 배로 희석하라고는 말안하구 "이렇게하면되겠네.." 이러셔서요..도대체 몇배로 희석이 된건가요.. 아 농도희석너무 어렵네요
회원작성글 정현222  |  2018.05.09
Q. 대장균에서 CRISPR-cas9 유전자가위 교정
CRISPR-CAS9 (크리스퍼-캐스9) 유전자 가위를 미생물 (대장균)에도 적용할 수 있는지 궁금합니다. 유전자 가위 서비스 업체에 문의해보니, 안 된다고 합니다. 혹시 대장균의 유전자를 knock-out 시키기 위해 크리스퍼-캐스9을 적용할 수 있는 사례나 방법을 알고 계신지 궁금합니다.
회원작성글 미국  |  2018.03.26
Q. 플라스미드 재조합
나노헬릭스에서 플라스미드 분리 키트를 구매하게 되었는데 플라스미드를 분리한 후 할 수 있는 활동에 어느것이 있는지 찾아보다가 유전자 재조합이라는 항목을 찾아보게 되었습니다 유전자 재조합을 할 수 있는 간단한 방법이나 간단하지 않더라도 방법을 설명해주실 수 있나요? 블루 화이투 스크리닝으로 변화만 관찰해도 좋습니다
회원작성글 Dlcks  |  2018.03.21
Q. 플라스미드 분리 방법좀요..
고등 2학년인데 항생제 내성 유전자 실험을 하려고 해요.. 아직 조사를 더 해봐야되긴 하겠지만 우선 찾은 거로는 플라스미드 분리를 해야 한다고 하더군요. 그리고 굳이 이 실험이 아니더라도 많은 유전자 실험이 플라스미드 분리를 필요로하는 것 같던데 플라스미드 분리방법 고등학생 수준으로만 혹시 알려주실 수 있으신가요? 그리고 플라스미드 분리가 고2 수준으로도 가능한 건가요?
회원작성글 kep0213  |  2018.03.14
Q. site-directed mutagenesis 실험시 PCR Band의 위치가 이상합니다.
현재 quick agilent 회사의 site-directed point mutation kit를 이용하여 point-mutation을 실험중인 대학원생입니다.전체길이 6.1kb정도의 Vetor의 80bp 부분의 염기를 T에서 G로 바꾸려 합니다. 프라이머는 바꾸려는 염기를 가운데로 양 옆으로 상보적인 서열 14mer로 총 29mer로 제작하였습니다. %GC는 약 55.1% Tm값은 77도입니다.Annealing Temperature를 72℃, Cycle 15회로 PCR하였습니다. PCR 후 10㎕만 이용하여 전기영동을 해보았습니다. 그러나 6.1kb가 아닌 약900-1000bp에서 밴드가 진하게 나타납니다. PCR mix에 DMSO를 넣어보기도 하고 Annealing temp.를 올려보기도 하고 프라이머 서열과 Template간 서열도 다시 비교하였으나 문제를 못찾겠습니다. 이상한 위치에서 밴드가 나타나는 이유는 뭘까요...? 밴드위치 무시하고 Transformation 해봤는데 Colony도 안뜹니다... 고수님들 도와주세요 ㅠㅠ...
회원작성글 AdNF  |  2018.03.02
Q. 전사인자 연구 관련 질문입니다
보통 promoter 부위의 변이에 따른 발현량의 차이는 luciferase assay로 보는 것으로 알고 있는데요전사인자 binding site 부위의 변이에 따른 발현량의 차이를 보고 싶은데 이건 불가능 할지요?논문 등에서는 주로 chip assay 등으로 binding 하는지 안하는지를 보던데 이렇게 간접적인 방법 외에는 불가능할까요?promoter부위에 luciferase를 달아준 plasmid와 전사인자변이형의 plasmid를 동시에 넣는게 가능하다고 할지라도....원래의 cell 자체가 발현하는 전사인자 때문에 발현량 차이를 보기 어려울 것 같아서요 ㅠㅠ아무래도 과발현시키는 변이형의 영향만 볼수 있는건지....전사인자변이형의 plasmid만 인식시키게 하는 tag는 없을까요?cell은 knock down 시킨 후 전사인자변이형을 발현시킨 protein을 넣어줄수는 없겠죠?
회원작성글 joanna  |  2018.02.02
Q. site directed mutagenesis PCR
 DNA PCR을 통한 mutant를 얻는 실험을 얻고자 하는데PCR후 Dpn1 처리 전에 gel로 DNA band를 꼭 확인해봐야 하나요??사수는 Dpn1 처리 전에 gel로 DNA band확인 후 PCR purification을 하고 그 이후에 Dpn1처리를 하라고 알려줬는데 실험실 다른분들께 여쭤보면 바로 Dpn1 처리를 한다고 하더라구요.큰 차이가 있나요?
회원작성글 실험돌이2  |  2018.01.31
Q. dna integrity number
 dna integrity number에 대하여 아시는 분 계신가요.DIN에 대한 정확한 의미와 어느정도의 수치 이상이여야 검사가 가능한지 궁금합니다.업체로 FFPE 검체를 보냈을때 수치가 2~3 밖에 나오지 않아 검사가 진행되지 않았다고 연락이 왔습니다. 의미와 어느정도의 수치가 있어야 검사가 가능한가 궁금하여 여쭙니다.
회원작성글 엔지에스  |  2018.01.21
Q. quikchange ii ( or ii XL) 을 쓰는데 콜로니가 뜨지 않습니다,
 안녕하세요 고수님들께 조언을 얻고자 질문을 남깁니다.저는 지금 새로 박사과정을 시작하면서 로테이션 중인데, 새로 생긴 실험실에서 혼자 작은 실험들을 해내고 있습니다. 그 중 하는 것이 10kb 정도 되는 (pLV 혹은 pcDH) 템플릿에서 아미노산 하나만 바꾸는 SDM 을 하고 있습니다. quikchange ii XL 로 하나의 SDM 은 성공했는데, 그 후로는 quikchange ii 로 진행하고 있습니다. 모든 것을 스탠다드 프로토콜을 따라서 거의 변형 없이 진행을 하였습니다. template 50ng, primer 125ng, 온도 시간 그대로. extension 10min (1kb/min) , cycle 18, 등등.. 프라이머도 매뉴얼로 계산해서 더블체크 했기 때문에 괜찮은 것 같습니다.. 25~27mer 에 78 도 이상..다만 transformation 에서는 키트 제공 strain을 사용하지 않고 oneshot-stbl3 / top10 을 교대로 사용하여 transformation 하였습니다. 50ul reaction 중에서 5ul ~ 10ul dpnI 처리된 DNA을 50ul comp cell 에 transformation 하였고, 결과는.... 콜로니가 전혀 나타나지 않고 있습니다.아직 셋업이 아직 완료가 안되어서 gel 을 내려서 reaction 상태를 보고 싶은데,  교수님께서 물려받은 공간에 etbr gel 시스템 밖에 없어서 그냥 이 과정은 사이버세이프가 올 떄까지 넘어가자고 하셨습니다. 그래서 약간 주먹국구식으로 하고 있긴 한데, 사실 dpnI 처리 후 그냥 transform 하는 경우가 많아서 별로 중요하게 여기지 않았는데, 콜로니가 하나도 생기지 않으니 해야 한다고 생각이 드네요...말이 길었는데, 선배님들께 여쭤보고 싶은 질문은 다음과 같습니다.1. 10kb 정도의 SDM 에 quikchange ii 와 ii XL 의 효율 차이가 큰지, 지금이라도 빨리 새로 xl 을 주문하는게 나을지 .. (혹은 lightening 을 사버릴까..) 돈이 돈인지라, 로테이션 학생이 함부로 material 을 구매하는게 눈치가 보입니다. ㅜㅜ2. quikchange reagent 사용시, 보통 50ul reaction이 제시되어 있는데, 제가 중국인 포닥 분께 처음 sdm 을 배웠을 때는, 20ul reaction으로 scale down 해서 하더라구요. 저는 그 스케일로 겁이 나서 하지 않았지만, 혹시 reagent 아끼시려고, 그렇게들 많이 쓰시는지 궁금합니다. 조심히 실험하는 대신 아껴 쓸 수 있다면 하는게 좋을 것 같습니다. 3. transformation 하실 떄, comp cell volume 과 dna volume 을 10:1 ~ 20:1 정도로 하는걸로 알고 따르고 있는데 5:1 도 괜찮나요? 선배님들 경험상 이게 중요한 스텝인가요?4. 보통 comp cell 주문해서 쓰시나요 만들어서 쓰시나요. 실패를 많이 할 거 같은데 커머셜 comp cell 들을 뭉텅뭉텅 낭비하니깐 다른 방법이 있따면 찾아야 할 것 같아요.5, (논외) Stbl3 strain이 보통 lb 에서 잘 안자라는 것 같은데, low salt나 2x LB로 키우면 잘 자랄까요?5ml  miniprep 으로 16hr culture시 100ug/ul 나옵니다..(먼산..)아 정말 로테이션 들어가는 곳마다 dna work으로 스트레스 너무 많이 받네요ㅎㅎㅎ이런 시행착오는 평범한 거겠죠..? 아무튼 답변 해주시면 정말 감사드리겠습니다.좋은 하루 되세요
회원작성글 행복하자  |  2018.01.15
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