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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > Small RNA Analysis
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Q. transfection 에 대해 문의드립니다. 첨부파일
bone marrow cell에 transfection 하는 실험을 하고 있습니다.특정 유전자를 knock down 시키는 siRNA 와 overexpression시키는 dna 를 가지고transfection을 하는데요amaxa, reagent를 사용해서 여러번 해봤는데control siRNA와 control vector를 넣었을때 그 특정유전자가 발현을 많이 하고 있습니다.ㅠㅠ(사진첨부 : 실제 데이터는 아니고 경향성)amaxa는 회사에서 추천해준 bone maarow용을 썼고reagent는 다른회사것으로 세가지 정도 바꿔서 해봤구요control siRNA도 두종류 정도 써봤고 control vector는 랩에서 다들 사용하는 것과 다른 랩에서 사용중인것으로 써봤습니다. 근데 매번 같은 경향성이 보입니다. ㅠㅠ왜 control이 WT과 같지않고 유난히 높게 발현되는지 모르겠어요 ㅠㅠ
회원작성글 qwer  |  2013.01.11
Q. 여러 siRNA를 mixing하여 infection/injection해보신분요!
안녕하세요,siRNA 실험을 한번도 해보지 않은 초보자 입니다 ㅠ보통 많은 실험자분들이 siRNA를 3가지를 합성하여 그중에 효율을 잘보이는 하나를 골라서 실험을 진행하는거로 알고 있는데요, 시중에 팔고 있는 siRNA를 보니 한 target에 대한 3~5종류의 siRNA를 섞어 놓은 것들이 있더라고요 (santacruz) 이처럼 동일 gene의 target sequence가 다른 siRNA를 mix하여 transfection or injection해본 적이 있으신 분의 조언을 듣고 싶습니다.1. siRNA 처치시의 농도가 매우 중요하다구 하던데, 여러종류의 siRNA를 이용시 siRNA의 농도는 각각의 duplex농도 혹은 siRNA들을 합친 농도중에 어느 농도를 타겟으로 하시는지요?2. 이렇게 각자다른 siRNA를 사용시에 배합하지 말아야 할 주의사항들이 있는지요?그외의 invivo jetpei를 이용하여 siRNA를 실험해보신분들의 많은 조언 부탁드립니다.
초보자  |  2012.12.31
Q. Dicer로 siRNA 만드는 반응질문이요
Human Recombinent Dicer 효소로 dsRNA를 끊어내는 실험을 하고 있는데요 너무 안돼요 ㅠㅠ.우선 끊어지는 siRNA양이 매우 적고요, 며칠전엔 그냥 호기심때매 siRNA 래더를 사서 Dicer반응(37도C에서)을 시켜봤는데, 래더가 사라진거 있죠..... Overdigestion 때문인가요? 아무리 그래도 Dicer와 siRNA를그냥  반응시키면 아무 반응도 일어나지 않아야 정상아닌가요???? 프로토콜대로 enzyme buffer양 다 넣고 있는데 왜 안되는지 모르겠어요. 반응시간도 12-16시간하는거(프로토콜대로)라서 원래 overdigestion이 일어나선 안되는데 왜 이런가요??? 고수님들 알려주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠ dsRNA의 문제 같지는 않은데 (예전 논문엔 잘 끊어짐) 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠ
박사초보  |  2012.12.27
Q. qpcr 결과 그래프 어떻게 그리나요?
결과가 나왔는데 그래프를 어떻게 그려야 하는지 모르겠네요.자비를 베풀어주세요.
부엉이  |  2012.11.26
Q. real time PCR 준비
real time 을 처음 해보는데 잘 모르겠습니다. 아직 개념도 확실치 않아서..물어볼 사람도 없고 답답하네요.실험실에 Taqman microRNA reverse transcription kit, Taqman microRNA assay kit 이 있습니다. Taqman microRNA assay kit 에는 두개의 tube가 있는데 RT, TM이라 씌어있고 찾아보니 RT라고 써있는 tube는 miRNA specific primer라고 되어 있고 TM은 miRNA-specific forward PCR primer, specific reverse PCR primer, miRNA-specific taqman MGB probe를 포함한 mix라고 되어 있습니다. 제가 하고자 하는 실험은 siRNA A, B를 cell에 transfection시켜서 target gene(C,D)에 대한 real time PCR을 해보는 것입니다.그럼 Taqman microRNA reverse transcription kit와 RT tube(miRNA specific primer)를 이용해서 cDNA를 합성한 후 real time PCR을 할 때 Taqman microRNA assay kit 와 TM tube를 이용해서 하는건가요?그럼 target gene(C,D)을 어떻게 확인하나요? cDNA 합성 후 TM tube가 아닌 target gene에 대한 specific primers와 probe를 이용해 real time PCR을 해야하는 거 아닌가요?이 TM tube는 miRNA level만 확인할 때 사용하는 건가요?도와 주세요, ㅜㅜ 
초보자  |  2012.10.16
Q. in situ hybridization 을 의뢰할 수 있는 실험실 또는 기업체가 있나요?
아시는분이 계시면 답변 부탁드립니다 ㅠㅡㅠ
회원작성글 얌생레쌀  |  2012.09.27
Q. siRNA와 mRNA란?
siRNA란게 뭔지는 알겠는데 실험에서 siRNA를 기전이나 시그널에 적용한게 어떤 의미인가요??예를 들면 siRNA: control, HIF-1a,HIF-2a ....이런 식으로 실험을 했다는 게 나열되어 있는 것들을 억제했다는 건가요?siRNA가 유전자 발현, 단백질 발현을 억제하던지 조절을 하는 거자나요??ㅋ그리고 mRNA는 micro RNA를 말하는 건가요??
회원작성글 연금술샤  |  2012.09.17
Q. Transfection 고수님들~ 도와주세요ㅠㅠ
이번에 처음으로 Transfection 을 하게 되었는데..siRNA의 stock이 10uM 입니다. 이 siRNA를 100pmol로 total media 2ml에다가 넣을려고 하는데10uM은 10nmol/ml 이니까 100pmol / 10000pmol/ml * 2000ul 이니까 20ul 넣으면 되는건가요?부탁드려요!! 
회원작성글 생명고냥이  |  2012.09.11
Q. 선생님들 제가 siRNA실험을 하는데요
lipofectamin을 이용해서 하는데 target RNA를 48hr si 시킨뒤약물을 또 48hr처리하게됩니다.음 그러니까 만약 제가 약물을 10nM로 처리를 한다고하면1. control2. 약물 10nM3. mock4. si RNA control5. si RNA + 약물 10nM이렇게set이 나오는데요 si결과를 보려고 웨스턴을 해보면1,2,3까지는 b-actin이 일정하다가 4,5에서 bactin이 아예 확줄어버립니다.lipofectamin에 약물까지하게되니 세포에독성을 띄게되어서 그럴꺼라고하던데이경우 어떻게 해야하나요???혹시 제가 si하고 약물을 처리하는 시간이 너무 긴가요????저처럼 48hr+ 48hr로 실험 한 적 있으신분 없나요??
회원작성글 웨스턴이시러요  |  2012.08.11
Q. aptamer 발현 확인 방법
현재 aptamer 실험을 하고 있습니다.계속 헤매고 있는 중이긴 하지만..;;;;aptamer가 cell에서 정말 발현이 되고 있는지 확인을 하고 싶습니다."aptamer 발현 확인 방법"을 아시는 분.. 부탁드려요..혹시 관련된 논문이 있다면 함께 알려주시면 감사해요
어려워  |  2012.07.30
Q. real time PCR 초보
real time PCR을 시작하려고합니다.제가 하려는것은 miRNA를 detection 하는 실험을 하려고하구요.그래서 실험에 들어가기전에 trouble shooting을 하고싶은데 많이 나는 error나 trouble shooting에 대해 여쭤보고 싶습니다.많은 답변부탁드립니다.
회원작성글 석사생  |  2012.07.13
Q. miRNA let-7 첨부파일
먼져 이 질문은 실험 관련 질문이 아닌 논문 관련 질문인데요논문 관련 질문은 어디에 올려야 하는지 몰라서 여기에 올려요제가 지금 miRNA let-7g 과 지방분화에 관련된 논문을 보고 있는데요논문에서는 계속 let-7이  세포의 증식과 암과같은 염증에관련이 있다는 데이터를 보여주며 let-7 과 지방분화에 대한 연관성이 있다고 나와있습니다물론 지방분화 인자들에 대한 데이타도 있고요게다가 암세포와 줄기세포가 비슷하기 때문에let-7이 줄기세포 분화에도 역할을 한다고 나와있는데자세한 설명은 없어서 논문 읽기가 힘든데 혹시이런 내용에 관해서 아시면 알려주세요 ㅠㅠ그리고 let-7은 왜 이름이miRNA375 같은 이름이 아니라 let-7이라는 이름인지 아시는 분있으면 알려주세요
회원작성글 동물세포실험  |  2012.06.08
Q. Santa cruz에서 구입한 siRNA...
SANTA CRUZ. 에서 siRNA를 구입했습니다.그런데 siRNA sequence가 data sheet에 안나와 있네요.. 같이 주문한 primer도 마찬가지구요 예전에 bioneer 에서 siRNA 주문했을 때는 data sheet에 sequence가 나와있었는데.. santa cruz.에 메일을 보내서 알려달라고 하면 알려줄까요..? ^^;; 도움 부탁드립니다..
수정  |  2012.06.05
Q. 어떤 siRNA design program 쓰시나요?
siRNA을 design 하려고 합니다만 최근에 많은 무료 design program이 없어졌더라구요.몇달 전만 해도 ambion에서 design했는데, ambion도 통합되고 나서는 바로 order하는 시스템으로 바뀌었네요. sequence도 모르고 섣불리 주문하기에는 시간이 많이 걸리고 비용도 만만치 않아서요.그래서 혹시 지금 사용하시는 siRNA design program이 어떤 것이 있나 여쭤봅니다.  검색을 해보아도 최근 것이 2008년에 작성된 답변이라 죄송하지만 같은 주제로 다시 올립니다. 
회원작성글 꿈꾸는파란  |  2012.05.21
Q. SRA 이용법에 대해서 아시나요.ㅠㅠ
NGS를 통해서 microRNA sequence를 NCBI에 올리고자합니다.찾아본결과 SRA 를 이용해서 올린다고 나와있는데 정확한 사용법을 몰라서요.ㅠㅠ보통 mRNA 나 DNA의 경우 BakIt 이나 Sequin 를 이용하여서 올리던데 micoRNA는 어떻게 해야하나요. 아시는분 자세한 설명좀 부탁드립니다.ㅠㅠ
회원작성글 힝힝  |  2012.04.20
Q. p38, Akt siRNA사용하시는 분께 도움을 청해봅니다..
안녕하세요~혹시 human cell에 p38, Akt siRNA transfection실험하시는 분 계신지요?pre-designed siRNA는 염기 한 두 자리 위치 변화에 따라서도 효율이 천차 만별인 것으로 알고있습니다. validated siRNA는 찾아봐도 찾아지지가 않는 군요..그래서 혹시 사용하고 계신 pre-designed siRNA 제품중 silencing이 잘되는 제품이 있으시면 추천해 주실 수 있는 지..도움을 청해 봅니다. 
회원작성글 EST  |  2012.04.05
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