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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein
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Q. cell, tissue의 단백질 사이즈가 다를 수 있나요?
monoclonal 항체를 이용하여 cell(skeletal muscle cell), tissue(skeletal muscle) lysate를 이용해 웨스턴을 했는데, cell에서는 원래 사이즈가 맞게 나왔는데 tissue에서는 사이즈가 다르게 나오더라고요 이럴 수 있나요? whole membrane에 항체를 붙였고, 원래 사이즈가 150인데 tissue에서는 60 언저리 정도로 나왔습니다..
회원작성글 별헤는밥  |  2022.11.22
Q. western blot gel 찢어짐 질문이요..
안녕하세요 선배님들ㅠㅠ western blot transfer 할 때 gel이 찢어졌는데 최대한 티 안나게 다시 붙여서 우선 transfer은 진행하였습니다ㅠ 이런 경우에 찢어진 부분이 티가 많이 날까요... 저와 같은 경험이 있으신 분들은 알려주세요..ㅠㅠ!
회원작성글 ㄹㄹ  |  2022.11.22
Q. ITC 측정 가능 여부
폴리머와 계면활성제간의 binding 양론을 보고자 ITC 측정을 하고 싶은데, 주로 생물쪽 연구에서 많이 쓰이는 기기다 보니 이런 용도로 쓰면 컨탬이나 고장 우려때문에 조금 꺼려하시는 분이 많으신 것 같습니다 ㅠㅜㅜ 혹시 이런쪽으로 ITC 기기 측정할 수 있는 곳 추천해주실수있으실까요ㅜㅜ 또, hexadecane 용매를 쓰는데 ITC 기기 측정에 큰 문제없을까요 답변해주시면 정말 감사하겠습니다!.
회원작성글 BRRIICCC  |  2022.11.21
Q. 단백질 정량분석 실험 결과 질문드립니다.
y = 0.0408x + 0.0127입니다.  sample 값은 0.3688, 0.3954 입니다. 1. sample 농도 값 구하는 방법 2. 50 ug 일 때 필요한 ul은 얼마인지? 자세한 과정과 함께 알려주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 펭귄뒤적  |  2022.11.21
Q. 단백질 전기영동 밴드 끌림 현상 관련 질문드립니다.
안녕하세요  단백질 전기영동 실험을 진행하고 있는데,  계속 밴드 끌림 현상이 생기고 있고 ㅠㅠ 여러 troubleshooting을 진행해보았으나 소용이 없어서 western blot 고수님들의 조언을 구하고자 합니다.    실험 조건은 다음과 같습니다.  1. C57BL/6 마우스 대장 조직 homogenate(상등액) 2. lane당 단백질 20 ug  3. Homogenate 샘플을 SDS loading buffer와 섞은 후 100도에서 15분 가열  4. lane당 샘플 10 ul씩 로딩  5. 전기영동 조건 200 V, 35분  6. Gel: bio-rad  Mini-PROTEAN TGX gels (10%)    Running buffer도 늘 새로 만들어서 충분한 양을 넣어서 실험하고 있고,  Gel 밑의 테이프도 잘 떼어서 사용하고 있습니다.    사진도 첨부하였으니  조건과 결과에서 제가 혹시 놓치고 있는 부분이 있는지 코멘트해주시면 정말 감사하겠습니다!! 
회원작성글 ㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎ  |  2022.11.21
Q. bca assay 정량 계산 법 알려주세요 ㅠ
결과는 다 나왔는데 여기서 엑셀로 그래프 그리는 법을 모르겠어요 y=ax+b 이걸 어떻게 구하나요 ? 그리고 R^2은 어떻게 구하나요 ?
회원작성글 미미미미ㅣ미밈  |  2022.11.21
Q. bca assay 정량 계산 법 알려주세요 ㅠ
결과는 다 나왔는데 여기서 엑셀로 그래프 그리는 법을 모르겠어요 y=ax+b 이걸 어떻게 구하나요 ? 그리고 R^2은 어떻게 구하나요 ?
회원작성글 미미미미ㅣ미밈  |  2022.11.21
Q. PI3Ka와 PIK3CA는 서로 다른가요?
브릭에 글을 처음 써봅니다.... 기초적인 질문일 수도 있지만.... PI3Ka (Phosphatidylinositol 3-kinase alpha)와 PIK3CA (Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha)는 다른 것인가요?    논문마다 다르게 사용하고 위키피디아 페이지도 따로 있던데 (https://en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_3-kinase , https://en.wikipedia.org/wiki/P110%CE%B1) 제가 혹시라도 다른 물질인데 같다고 착각하고 있을까봐 질문을 드립니다. kinase kinase kinase를 3K로 줄여도 되고 K3로 줄여도 되는 것이지요? 여쭤볼 곳이 없어서 여기에 여쭙게 되었네요 ㅠ 간단한 질문 죄송합니다, 감사합니다.   (두 위키 페이지를 자세히 읽어보니 PIK3CA는 유전자 이름이고 PI3Ka(또는 p110-α)는 단백질 이름이라고 이해하면 될까요?)
회원작성글 무민2  |  2022.11.20
Q. NF-kB p65 항체
초보 실험실생입니다. 이번 WB 실험을 하면서 p65 항체를 phospholylation/total을 봐야해서 항체를 알아보고 있는데, polyclonal로 찾고 있습니다. sample은 mouse입니다 인산화 부위가 다른게 많던데 어떤 항체를 봐야하는지와 이유까지 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 문어체  |  2022.11.18
Q. 단백질 인산화 분석 업체 (LC-MS) 추천해 주세요
안녕하세요. 마우스 뇌 조직에 특정 단백질의 인산화를 분석하려 하는데, 시판되는 해당 단백질의 인산화 항체가 없어, LC-MS를 통해 인산화 분석하려 합니다. 이러한 실험을 대행해주는 실험실이나 업체를 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 bluehawk  |  2022.11.18
Q. His tag purification 실패 원인
안녕하세요 현재 3학년 2학기째 재학중인 학부연구생입니다 현재 BL21(DE3)균주에 형광단백질 (mCherry와 다른걸 붙여 만든 단백질입니다 교수님께서 만드신거라 자세한 사항은 생략하겠습니다) 플라스미드를 넣은 후 키워 lysis 한 뒤 protein extraction을 하였습니다 Induction도 잘 되었고 protein 추출 후에 UV램프로 확인하였을 때도 잘 발현된 것을 확인 하였습니다 그 후 His-tag purfication을 통해 단백질 정제를 진행하였는데요 문제는 Binding buffer, wash buffer에 단백질이 거의 추출되고 Elution 후에 단백질에는 형광도 발현되지 않고 브래드포드를 통해 확인한 결과 농도 또한 낮았습니다 현재 레진은 thermoscience 제품을 사용하고 있습니다 카탈로그 넘버는 88221입니다 buffer의 조성의 경우는 제품의 프로토콜 그대로 진행하였으며 그전 LGG protein을 추출할 때도 프로토콜대로 진행하였을 때 잘 되었는데 이번에 LGG 또한 Elution이 되지 않았습니다 다른 선배들이 뽑으셨을 땐 프로토콜 그대로 했을 때 문제가 없으셨다고 해서.. 저의 손의 문제거나 버퍼를 잘 못 만든것으로 추측을 하고 있습니다 혹시 buffer의 이미다졸 양을 낮추면 제대로 Elution이 될까요? binding 버퍼는 10mM의 이미다졸, wash 버퍼는 25mM의 이미다졸, Elution 버퍼는 250mM의 이미다졸을 사용중입니다 빨리 정제를 해야 다음 스텝으로 넘어갈텐데 마음이 조급하네요ㅠ ㅠ ..
회원작성글 응앵애  |  2022.11.18
Q. lysis buffer 거품
Lysis buffer로 cell을 lysis 한 후 4도씨 냉장고에 10-30분 정도 둔 다음,  13000rpm, 10분에서 centrifuge를 한 후 sup만 따서 새로운 e-tube에 놔둡니다. 실험이 추후에 진행할 시 냉동고에 얼린 후  다시 녹여서 vortex를 진행하는데, vortex 한 후 spin down을 해도 거품은 사라지지 않았습니다.  혹시 거품을 최소화하고 정확하게 정량 하는 방법이 있을까요 ㅜ 
회원작성글 카스테랑  |  2022.11.17
Q. HPLC prep 후
prep HPLC로 peak의 fraction을 받아와서 동결건조를 시켰는데, 이 단백질을 최대한 오래 보관하면서 처리 실험에 사용하려면 보통 어떤 식으로 보관하나요? prep HPLC를 했던 조건의 용매로 녹여도 괜찮은건가요 (비슷한 단백질을 정제한 논문의 HPLC 조건임) ? 아니면 추출시 사용한 유기용매에 녹여둬도 되나요..? 그 단백질이 안정한 버퍼 조건을 찾아봐야하나요? 단백질을 주로하는 랩이 아니라 조언이 필요합니다 ㅠㅠ
회원작성글 ziw  |  2022.11.17
Q. 백그라운드를 미친듯이 타고 밴드가 연한 현상,, 저 졸업 못할거같아요ㅜㅜ 제발 도와주세요,,
tnf-a를 보고있고 데이터 시트가 항체를 5% bsa에 희석하여 사용하길 권장하여 1:1000으로 사용 중에있습니다. 회사는 셀시그널링입니다!   항체를 skim에 사용했더니 시그널이 아예 뜨지 않아 bsa를 사용하고있고 그러니 잘 뜨긴했습니다.(왼쪽이 현재 상황, 오른쪽이 잘뜨던 날,,입니다.)   그런데,, 딱 한번만 잘뜨고 그 이후로는 밴드가 저렇게 백그라운드를 미친듯이 타면서 밴드는 연하게 뜹니다. 디벨롭을 조금만하면 아예 저것 조차 뜨질 않구요. 아주 강하게 하면 멤브레인을 태우면서 겨우 저정도 밴드가 보입니다..   블락킹은  프로토콜대로 스킴밀크에서 2시간 수행했고, 안티바디 1차는 bsa 1:1000 오버나잇 2차는 bsa로 1:4000을 붙이고 워시를 10분간 5번 수행했습니다.. 대체 뭐가 문젤까요,, ㅜㅜ 갑자기 왜 저렇게 백그라운드를 타면서 밴드는 연하게 나오는 걸까요,, 3일쨉니다. 같은 문제가,, 현재 스트리핑 중에있습니다. 새로 붙여보려구요,,   
회원작성글 진vv  |  2022.11.17
Q. 연구자 본인의 체액으로 실험 ,,, ?
안녕하세요   엑소좀 관련 연구를 준비하고 있는 석사 2학기생 입니다!!   슬슬 졸업 논문이 될 동물실험을 계획하고 있습니다. 이제 본 실험을 들어가면 웨스턴을 통해 exosome marker 확인도 해야하고, 또한 특정 조직 유래 exosome 마커를 활용한 2 step Exosome isolation 을 진행중인 만큼 해당 마커도 확인하기 위해 웨스턴을 필수적으로 연마해야 합니다. 하지만 현재 웨스턴 블롯이 아주 미숙한 상태라 많은 연습이 필요합니다. 2step exosome isolation 프로토콜 확인 및 웨스턴 연습을 위해 cell culture를 통해서 exosome을 취득하고 있는데, 문득 너무 비효율적이라는 생각이 들었습니다. 특히 오늘 ,, protein 정량을 위해 BCA assay를 진행했는데,,, 어디선가 날려먹었는지 cell culture 부터, 처음부터 다시 해야할 수도 있다는 생각에 이런 생각이 더욱 강렬하게 들더라구요,,,, cell culture medium을 통해 exosome을 취득하려면 그 양 자체가 적어서 많은 양을 키웁니다.(150mm x10, 이렇게 나온 exosome을 다 합쳐야 웨스턴 할만한 양이 나오더라구요 ,,) 또한 조직별로 구분하는 만큼, 조직의 수 만큼 더 많아지구요,,, 2~3조직으로 하면 150mm 30판,, 연구실이 작고 다들 바빠서 혼자 합니다 물론 혼자 하는게 당연한거긴 한데,, 그래서 그냥 제 소변을 이용하면 어떨까라는 생각이 문득 들었습니다.. exosome isolation 키트, 안티바디 모두 호환이 되서 당장 실현은 가능합니다만 너무 미친사람이 되어가는게 아닌가 우려가 되어서,, 혹시 저같이 본인의 혈액, 소변 등을 이용해서 파일럿 혹은 연습 실험하는 사람이 있는지 궁금해서 글 올리게 되었습니다... 아 물론 제 몸에 케미컬 인젝션은 안합니다,,,
회원작성글 사자돼지  |  2022.11.16
Q. 조직 단백질 웨스턴 도와주세요ㅜㅜ
마우스 골격근을 액체 질소에 얼려서 부수는 방법으로 균질화를 하고 있고 이후 Pro-prep이라는 lysis 버퍼 제품을 이용해 lysis 합니다. 프로토콜 대로 lysis 해서 protein을 추출한 뒤에 sample버퍼와 함께 95도에서 5분간 가열하여 로딩합니다. semi-transfer로 25V 40분 합니다. 중요한건 GAPDH, ACTIN은 잘 나오는데 제가 보려는 사이즈의 단백질(150kDa)이 너무 이상하게 나오거나 안나옵니다.. lysis가 문제인건지 sampling 할 때 온도를 좀 낮춰서 해야할지 모르겠네요.. 잘 모르는 놈 도와주시면 정말 감사드리겠습니다ㅠㅠ
회원작성글 별헤는밥  |  2022.11.16
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