혈액 또는 조직(간)에서 sod, catalase, GSH-peroxidase를 매뉴얼로 측정하려고합니다.매뉴얼로 측정하되 샘플수가 많아서 큐벳이 아닌 96well plate를 사용해서 측정하려고 하는데요프로토콜있으신 분은 알려주세요~  논문을 찾아봐도 kit으로 측정한것은 많은데 매뉴얼로 한것은 별로 없고 무슨 말인지 잘 모르겠네요... ㅜㅜ

surface biotinylation후, triton x-100 1% 들어있는 lysis buffer로 진행 하였는데, avidin pull down fraction에서 biotinylated target protein이 너무 약해서, Plasma membrane solubilization이 덜 된건가 싶어, lysis buffer를 바꿔보고자 합니다. RIPA buffer들을 사용한 논문을 봤는데, 이론적으로는 문제가 없는 것으로 찾아 보았으나, RIPA BUFFER 는 biotin-amine 같의 결합 및 avidin간의 결합에는 영향을 주지 않는지요?

안녕하세요 석사 새내기 입니다....ㅠㅠ제가 지금 GSH와 어떤 protein으로 invitro 상태에서 binding을 볼려고 IP를 준비하는데요이 물질2개를 반응시켜 SDS-PAGE gel로 확인하려 합니다.물론 B-mercaptoethanol은 빼구요.그런데 SDS를 넣어줘도 GSH가 protein에 떨어지지는 않나요?생각해보면 떨어질것 같기도 아닐것 같기도 하구요....ㅠㅠ찾아봐도 나오지 않아 이렇게 문의드립니다.고수님의 친절한 답변 기다리겠습니다.읽어주셔서 감사합니다. 

co-ip를 몇개월동안 진행 중인데 계속 같은 결과가 나와서 도움을 받고자 합니다..cMyc과 FLAG을 각각 tagging한 유전자를 co-transfection 하였구요,일단 제가 진행한 procotol은.. (좀 길지만 잘못된 부분이 있는지 봐주셨음 해서요..ㅜ) 1. 재료 - Protein A/G plus agarose (Santacruz, #SC-2003)  - NP-40 cell lysis buffer (Invitrogen, #FNN0021) w/ protease inhibitor (pierce)  - Normal rabbit IgG (Pre-clearing 할 때 사용, Santacruz #SC-2027) : rabbit 을 사용한 이유는, IP할 FLAG 항체가 rabbit이기 때문에  - FLAG antibody (IP: rabbit #F7425, WB: mouse #F1804, Sigma)  - c-Myc tag antibody (Cell signaling, #2276) 2. Procedure   i. Cell harvest   - Culture는 6-well plate 사용 - Media 제거 후, PBS 1ml -> scrapper로 긁어서 E-tube - 5000rmp, 4도, 2min - PBS washing - -80도 저장   ii. Cell lysis - NP40 lysis buffer 1ml 넣고 vortexing - 30min, ice or -20도: 10min 마다 vortexing - 13000rpm, 4도, 5min centrifuge - 상층액따서 E-tube (lysis 과정은 Invitrogen protocol에 따라 진행) - Bradford assay로 농도측정    iii. Immunoprecipitation · Pre-clearing - protein 500ug + Normal rabbit IgG 1ug + bead 20ul -> 4도, 1시간 rotation  (이 때 잘 섞이게 하기 위해서 lysis buffer를 넣어서 1ml 정도로 맞춤) - 1000g or 2500rpm, 4도, 5분 centrifuge   · 1차 항체 binding   - 상층액을 new tube에 넣고 FLAG (rabbit) 1ug 첨가   - 4도, overnignt, rotation   · Bead binding   - protein, 1차 항체 들어있는 tube에 bead 20ul 첨가   - 4도, 1시간 or overnight, rotation     · Washing - 1000g or 2500rpm, 4도, 5분 centrifuge - 상층액 제거 - Lysis buffer (protease inhibitor 포함) 1ml 넣고, inverting - 1000g or 2500rpm, 4도, 5분 centrifuge - 5번 반복 (상층액 제거할 때마다 약 50ul 정도 남김, bead loss 방지)   · Elution - 마지막 washing 시, 최대한 상층액 제거 - 1x sample buffer (Bio-Rad, beta-mercaptoethanol 포함) 20ul 넣고 - 95도, 5min boiling - 1000g or 2500rpm, 4도, 5분 centrifuge - 상층액만 loading -------------------------------------------------------------------------------------------결과는 위에 사진과 같습니다.. 일단 IP 부분의 밴드가 너무 지저분하게 나오는게 문제인데요.. 사진 상에는 옅어보이지만 실제로 ECL을 뿌리면 형광이 너무 빵빵하게 보일만큼,membrane이 갈색으로 바랠만큼 signal이 강합니다.. (필름을 살짝 붙였다 떼도 마찬가지)IP는 rabbit으로 하고 WB는 mouse 항체를 쓰는데도 저렇게 heavy chain과 light chain이 강하게 뜰 수도 있는건가요..? H/L chain이 뜨는걸 막아준다는 ROCKLAND 2차 항체를 써도 마찬가지 결과가 나왔습니다..유전자 A와 B가 결합하는지는 저도 모르지만 일단 밴드 자체가 저렇게 나오니 결과 분석조차 하지 못하고 있는 상태입니다. 일단 가장 큰 문제는 밴드가 끌리듯이 아주 강하게 나온다는 것이구요,, 제 protocol 상에 문제가 있나요..? 아니면 그 전에 다른 곳에서 제가 잘못했을까요.. ㅠ 어느 부분을 확인해봐야 할지 도저히 감이 잡히지 않습니다..transfection 조건 잡을때도 밴드는 아주 깨끗하게 나왔는데요ㅜ 거의 5개월 가까이 제자리걸음입니다.. 조언 부탁드릴게요..

몇 퍼센트 나 붙었을지 확인해볼수 있는 방법이 있나요?처음 계획은 uv peak값의 변화 로확인해보려해으나 peptide내에 T,W,F 같은 것이 없어서...

santacruz bead (sc-2003)bead로 IP를 하고 있습니다. protocol은 bead와 함께 온 protocol대로 진행하고 있구요,bead는 20ul를 사용하는데 elution 단계에 보면 40ul의 1x sample buffer를 넣으라고 되어 있습니다.여기서 궁금한게 있는데요, 1x sample buffer 라는게 2x(또는 4x) sample buffer를lysis buffer를 사용하여 1x로 희석시킨 다음에 40ul를 넣으라는 건가요..? 아니면 sample buffer자체를 넣으라는 걸까요..? (물론 beta-mercaptoethanol 첨가하구요)다른 bead를 사용하였을때는 50ul의 bead를 사용하라고 되어있었고,50ul의 1x sample buffer로 elution 하라고 되어 있었는데이 때 저는 50ul의 2x buffer를 넣어서 최종 1x로 만드는 것이라고 이해하였습니다. 제가 이해한게 맞는건가요..?

안녕하세요?지금 구조 생물학 쪽 시작한 초짜입니다.다름이 아니라, drug design을 하기 위해 어떤 단백질 예를 들어tumor suppressor 단백질인 A라는 단백질과 결합하여 그 기능을 무력화시키는 B라는 target 단백질이 있을 때, B단백질의 inhibitor를 만들기 위해서는B라는 단백질의 구조를 먼저 풀고 결합가능성이 있는 자리를 찾아야 하나요?아니면 B와 A의 complex구조를 먼저 풀고 결합자리를 확인해야 하나요?(complex구조 푸는 것 단일단백질에 비해 어렵나요?)제가 이 분야를 이제 시작해서 잘 모르겠네요.아시는 분 혹은 의견 있으신 분들 답변 부탁드려요.감사합니다^^

rat brain 얼린것을 사려고 하는데, 인터넷을 아무리 뒤져도 안나오네요.lysate나 extract는 있는데 대부분 WB용으로 SDS buffer로 처리한거라서... 이런경우 rat을 사서 해부하는게 최선일까요?

gst pull down assay에 대해 논문을 봤는데실험 원리나 여기서 나오는 input이 positive control이라는 건 알겠는데이게 western 시 뭘 내려서 positive control인지 모르겠네요가르쳐 주시면 정말 감사하겠습니다.

지금 실험실에서 사용 가능한 antibody가 하필 HRP conjugated 된 primary antibody 뿐이네요..이게 protein AG agarose에 붙을까요? 아니면 HRP 때문에 붙지 않을까요 ??

안녕하세요 아직 공부가 부족한 박사과정학생입니다.293t에 transient overexpression 한 sample로 IP-MASS 를 진행하니 degradation form만 detection이 되서 제대로 된 결과를 얻을 수 없었습니다.아마 제가 IP 한 단백질이 E3 ligase 여서 그럴 수 있다고 생각이 듭니다.사이즈도 워낙 큰 단백질이여서 골치가 좀 아픈데요target 을 찾고 싶은 마음이 커서 고수님들께 여쭤봅니다.endogenous IP를 하려고 계속 세포를 모으고 있는데요 100장정도는 모아서 IP를 할 예정입니다.cell line이라 1장에 못해도 1mg 의 lysate는 얻을 수 있을거같구요 endogenous 단백질 양은 꽤 높은 편입니다.1mg 당 0.5~1ug 의 항체를 쓸 예정입니다.혹시 endogenous IP로 mass 찍어서 interacting protein을 동정해보신 분 계시면 comment 부탁드립니다.감사합니다 

제가 서로 interaction 할 것으로 예상되는 protein A와 B를 co-ip를 통해 확인해보려 하는데요...제가 A에는 Gfp를 B에는 Rfp tagging을 해두었는데Gfp가 tagging된 A를 발현하는 cell에서 protein을 prep.하고 Rfp가 tagging된 B protein을 발현하는 cell에서 protein을 Prep.하고 두 protein들을 섞어서 co-ip를 하면 되는건가요??알려주세여ㅠㅠ

IP를 계속하고 있는 학생입니다.IP를 하여 Coomassie blue staining을 하면, Input 대비 protein잡히는 양의 차이가 어마어마하게 나서 분명 IP가 된 것 같거든요.(물론 그 band size에서 protein도 잘 잡히고요.)그런데 IP한 protein을 그 protein antibody를 사용해서 WB으로 확인을 하면, Negative control인 Mouse IgG로 땡긴데에서도 band가 같은 위치에서 나옵니다.(protein size는 155 kDa 입니다)이 문제가 해결이 안되서요. 왜 그럴까요?

안녕하세요.저는 TUBEs (tandem ubiquitin binding entities)라는 일종의 IP: Ubiquitin인 실험을 하고 있는 학생인데요~ 몇 번의 테스트를 거쳐 거의 모든 스텝을 optimization하긴 하였으나...아직도 정량하는 부분은 어렵네요. 예를 들어, protein sample을 BCA assay로 정량할 때 lysis buffer를 얼마나 사용하는지, INPUT은 몇 ug이나 loading하는지 아직 판단이 어려운데...혹시 TUBEs 실험하시는 분 계시다면 도와주세요^^!

flag을 붙인 단백질과 myc을 붙인 단백질을 동시에 transfection하여,co-IP를 수행하고 있습니다. 아직 초보단계구요..IP는 flag으로 했고 (sigma, rabbit)control rabbit IgG 1ug 과 protein A/G 20ul 넣고 1시간동안 pre-clearing,상층액만 따서 flag 항체넣고 (1ug) 4도에서 overnightbead 20ul 넣고 1시간washing (pbs w/ 0.2% tween20) 5분씩 7번elution이 순서로 진행하였습니다.  Input과 IP 그룹에서 western을 수행한 결과,input에서 mock (lipofectamine only) 그룹에서는 flag 이 detection 되지 않았는데ip 의 mock 그룹에서 flag 이 잡힙니다.. 뿐만아니라 myc-tagged protein 만 들어간 그룹에서도 잡히구요,, 즉,그룹1 mock그룹2 myc-tagged protein그룹3 flag-tagged protein그룹4 flag tagged+myc-tagged으로 구분하였고, input의 결과는 정상이나 flag으로 IP를 했을때모든 그룹에서 flag이 detection 되었습니다. (IP와 WB 에서 host 다른 flag antibody 사용)한번 배우고 계속 제가 혼자하고 있는 중이라trouble shooting 이 전혀 되고 있지 않아서 이렇게 도움 요청합니다..pre-clearing 과정에서 문제가 있었을까요? 조언부탁드릴게요.. ㅜ

Immunoprecipitation 할때 쓰는 protein A/G agarose bead에 bead가 가라앉아 있어 보통 vortex를 많이 해서 resuspension 시켜서 사용하였었는데요.오늘 연구실의 다른 분이 그러면 bead 가 깨질 수 있다고 위 아래로 방향 바꿔주면서 흔들어서 섞어야 된다고 하시네요..구글이나 찾아봐도 특별히 이에 대한 언급이 없는것 같은데요..vortex 오래 세게 하면 bead가 깨질수도 있는지 궁금합니다.감사합니다!