[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
ACROBIOSYSTEMS
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioLab 장재봉 교수
전체보기 안전점검 LABox
 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
카테고리 전체보기펼치기
질문/투표/프로토콜 등록
Q. WB 항체를 고르는 중인데 이 조합이 맞을까요?
연구실에 전임자가 없어서 저 혼자 알아보고 있는데 제가 맞게 이해 한 건가 싶어서 질문드려요... 현재 대장균에서 발현/정제 중인 단백질이 10종류가 넘고, 모두 8x His-tagged protein이라 anti-his tag 항체를 사용하여 WB로 확인하고자 합니다. 현재 연구실에 있는게 NBT/BCIP 용액 뿐이고 이거를 쓰려면 AP conjugate를 구매해야 한다 해서 찾아 본 결과가 모 회사의 이 제품들인데 1차항체: 6x-His Tag mouse Monoclonal Antibody IgG2b (His.H8) 2차항체: Rabbit anti-Mouse IgG F(ab')2 AP   제가 이해한 바가 맞다면 1차항체는 mouse에서 나온 IgG 중 type이 IgG2b만을 모은 것이고, 2차항체는 rabbit에서 생산한 모든 mouse IgG에 대한 항체이지만 IgG의 Fc domain은 인식하지 않는다.... 인데 F(ab')2의 정확한 의미를 모르겠습니다. 이대로 구매해서 사용해도 문제는 없을까요?   그리고 확인할 단백질들이 His tag가 N말단에만 있는 것도 있고, C말단에만  있는 것도 있고, 양 말단 모두에 있는 것도 있는데 아무래도 양 말단 모두에 태그가 있으면 WB 밴드가 조금 더 진하게 나타나나요?  
회원작성글 ckk  |  2022.09.08
Q. 단백질 정량(Bradford/BCA assay) 계산이 잘 이해되지 않습니다..
안녕하세요. western blot을 진행하는데 두 분의 선임이 각각 실험하시는 과정을 보고 정리하여 혼자 실험을 하려고 하는데요,  그런데 두 분의 단백질 정량 계산법이 달라 무엇이 맞는지 정확히 알지 못하여 선생님들께 도움을 구하고자 합니다.   먼저 첫번째 선임의 방법입니다. cell pellet lysis 후 Bradford 방법을 이용하여 standard 농도를 0, 1, 2, 4, 8로 지정 후 측정한 결과입니다.  단백질 100ug의 100ul 샘플용액을 제조하고자 할 때 sample number(Conc.) 넣을 protein 양 reducing buffer sample buffer lysis buffer WT(7.9ug/ul) 100/7.9=12.7ul 100/10=10ul 100/4=25ul 100-12.7-10-25=52.3 #11(6.1) 100/6.1=16.4 100/10=10 100/4=25 48.6 실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : NP-40, reducing buffer : Bolt sample reducing agent(10x), sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다. 위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다. 그렇다면 제가 넣은 단백질 양은 30ug이 맞나요?   다음은 두번째 선임의 방법입니다. 제 담당 선임이셔서 계속 이 방법으로 실험을 진행해야 하는데 계산과정이 이해되지 않아서요.. cell pellet lysis 후 BCA assay kit를 이용하여 측정했습니다. sample number Conc.(ug/ml) ratio to 최소양 샘플 4x buffer 필요샘플양 1x buffer 원하는 final wb 샘플 양 #1 1369.500 5.989 26.5ul 13.27ul 66.23ul 106ul #5 228.667 1.000 26.5 79.50 0.00 106 실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : M-PER mammalian protein extraction reagent, sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다. 1x buffer는 4x buffer를 H2O에 희석하여 만들었습니다. 위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다. 위 표대로 만든 샘플은 106ul에 각각 228.667ug의 단백질을 가지고 있는 건가요? 30ul를 로딩했을 때 제가 넣은 단백질 양은 어떻게 되나요? 최저농도로 나온 샘플의 양이 얼마인지 피펫팅으로 대략 파악 후 엑셀에 대입하여 주신 자료입니다. 왜 이렇게 최저농도인 샘플의 양에 맞춰 나머지 샘플 모두 계산을 하는 것인가요? 첫번째 선임의 실험방법보다 이 실험법이 더 정확한건가요? H2O 대신 1x buffer를 넣는 이유는 무엇인가요?   그리고 만들어진 gel을 사용하는데 well 안에 running buffer를 채운 후에 샘플 loading 해도 되나요? 빈 well은 소량의 ladder를 넣은 후 샘플과 동량 맞추기 위해 부족한 양만큼 1x sample buffer를 넣어주나요? transfer 할 때 filter paper와 membrane이 함께 들어있는 novex filter paper sandwich 0.2um pore size를 이용하는데요, methanol에 담갔다가 transfer buffer에 적셔 이용하는 것은 filter paper인가요? membrane인가요? 
회원작성글 notorious..  |  2022.09.07
Q. PARP-1, Caspase3, p53 질문드립니다.
안녕하세요. 현재 암세포에 약물 처리 후 apoptosis보는 중입니다. ​ western중에 궁금증이 생겨 질문드립니다. ​ 1. parp-1(cell signaling 9542s) 를 봤는데 이러한 형태가 나왔습니다. (순서 - 10uM, 5uM, 1uM, control)      total form, cleaved form 둘다 증가하는데 다른 논문들을 보면 cleaved form은 증가하나 total form이 일정하거나 줄어드는 경우가 있더라구요. 어떻게 해석을 해야할지 모르겠습니다.. ​ 2. caspase3(cell signaling 9662s)를 봤을때입니다. (순서 - 10uM, 5uM, 1uM, control)    total form은 줄어드는데 cleaved form이 detect되지 않습니다.  듣기로는 caspase들의 cleaved form은 잘 보이지 않는다는데 팁이 있다면 부탁드립니다.   3. P53이 53사이즈에 나오지 않고 40정도에서 detect됩니다. (cell signaling 2524s) cell은 DLD-1, HCT-116입니다 아직 phospho form은 못봤지만 일반 p53이 하나도 안뜨는건 아닌거같고 40에 뜬 밴드는 그냥 무시해도 좋은 잡밴드일까요?   protocol dead cell까지 harvest 하여 sample을 제작하였습니다. 15%, 10% gel Loading, stacking 50V / separating 100V 250mA 70min transfer (in ice) blocking(5% skim milk/ 1h RT), 1st ab(5% BSA/ 1:1000 4도 O/N), 2nd ab(5% skim milk/ 1:10000 1h RT) 각 과정 사이의 washing은 TBS-T 5min 3회입니다. ​ 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 셀러문  |  2022.09.07
Q. 웨스턴 running시 끌리는 현상 첨부파일
tissue에서 추출한 protein sample로 running을 하는 중에 사진 처럼 끌리는 현상이 몇 개 있어서 왜이렇게 된 것인지 여쭤보고자 글을 올립니다. 처음 loading할 때에도 약간 sample이 뭔가 물기 없는 슬러쉬 같이 살짝 굳어보였습니다...
회원작성글 별헤는밥  |  2022.09.06
Q. low MW western 실험 도움 요청합니다.
안녕하세요. 4kDa 단백질(amyloid beta 42) 잡기 위해 웨스턴 조건 잡고 있습니다. 맴브래인 단백질이 최대한 잘 붙게 하기 위해 아래와 같은 조건으로 진행을 했습니다. 그런데 사진처럼 5kDa 근처 맴브래인만 특이적으로 투명화 되는 현상이 반복적으로 일어나고 밴드가 잡히지 않습니다. 이런 현상이 일어나는 원인이 무엇인지 알고 계신 분 자문 부탁드립니다... 그리고 low MW 단백질 잡기위한 좋은 팁 알고 계시다면 첨언 부탁드립니다.   <웨스턴 조건> 1. Gel casting - 4~20% gradient gel 사용 - Running at 100V for 50~60min   2. Transfer - MeOH per ct. 40% (맴브래인 접착 높이기 위해 40%로 높임) - Membrane pore size: 0.2um (PVDF) - 70mA for 1hr - After transfer, membrane boiling (T-TBS(0.05%) for 5min) and semi dry   3. Blocking - 3% BSA in T-TBS for 1hr   4. Antibody -1st antibody con.c 1:1,000 in T-TBS(0.05%) -2nd con.c 1:10,000 in T-TBS (0.05%)   5. Wash - 0.05% T-TBS( wash 하면서 단백질 lose 줄이기 위해 트윈 20 비율 줄임)
회원작성글 seraph924  |  2022.09.05
Q. 콜라겐펩타이드 확인방법
안녕하세요! 혹시 콜라겐펩타이드 확인방법 있을까요? 식물에서 추출한 콜라겐을 효소를 가해 처리하면 콜라겐펩타이드가 된다고 특허에 많이 나와있는데 저분자콜라겐이라는 증명이 없더라구요 특허에 보면 200dal 또는 300da톤 이라는데 왜 확인방법은 없을까요? 답변좀 부탁드립니다.
회원작성글 Sdr  |  2022.09.03
Q. 웨스턴 블랏용 단백질 추출
보통 60파이에 seeding 한 cell에 drug를 24시간 treat하고 난 뒤, western blot sample을 준비합니다.  1.죽은 cell까지 harvest하기 위해, media를 suction하지 않고 media는 걷어서 1.5 ml tube에 모은뒤에 2.10000 rpm에서 30 sec - 1 min 동안 centrifuge를 하여 pellet이 만들어 지도록 합니다.   3.media를 suction한 후, cell pellet을 ice에 박아둔 뒤  4.부착되어 있는 cell을 한번 피비에스로 워싱한후 lysis buffer을 넣어서 lysis 되도록 놔둔 후, 스크래퍼로 cell을 긁고나서 3번 cell pellet에 함께 넣어 cell이 잘 lysis 되도록 피펫팅을 여러번 합니다.  5. 4도씨 냉장고에 10분간 넣어두거나 ice에 박아둔 상태로 30분간 놔둡니다. 6.12000 rpm에서 10분 또는 15분 동안 centrifuge를 한 후 pellet이 생기면 상층액만 따서 추후에 BSA로 정량을 합니다 이때 피비에스로 워싱하는 과정을 생략해도 될까요? 
회원작성글 카스테랑  |  2022.09.02
Q. 마우스 근육 조직 단백질 beta-tubulin
skeletal muscle cell을 lysis해서 웨스턴 할 때는 beta-actin을 주로 보던데 왜 skeletal muscle tissue를 lysis해서 웨스턴 할 때에는 beta-tubulin을 주로 보나요? 그리고 kidney lung liver tissue protein을 같이 볼때도 beta-tubulin을 붙여도 될까요?
회원작성글 별헤는밥  |  2022.09.02
Q. NAGase 1차 항체를 구매하려는데... 이런 case는 선생님들은 어떻게 해서 결정하시는지 궁금합니다.
안녕하세요.   오늘도 웨스턴으로 고통받고 있다 질문 올려봅니다 ㅠㅠ   1차 항체를 주문하려는데, 같은 회사 같은 name 인 경우가 있더군요   Polyclonal Antibody to N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase (NAGase) MBS2007249 from MyBioSource.com | Biocompare.com   Polyclonal Antibody to N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase (NAGase) MBS2004706 from MyBioSource.com | Biocompare.com   N-Acetyl Beta-D-Glucosaminidase (NAGase) 1차 항체를 알아보고 있는데,   1) 위 항체는 위 회사 외엔 찾질 못함 2) 두 링크 다른 정보는 cat#, protein sequence - protein sequence로 blast해보니... 구분을 위한 결과가 나오진 않음 3) 둘 다 citation된 논문이 없음   이런 경우는 항체 choice를 어떻게 해야 할까요??   고수 선생님들의 조언 부탁드립니다 ㅠㅡㅠ   감사합니다.      
회원작성글 kodo2001  |  2022.09.02
Q. stripping
처음 membrane을 찍고 band가 잘 나오길래 stirpping해서 다른 antibody 결과도 얻으려고 진행 했는데요, 처음 잘 나왔던 밴드가 stripping 진행 후 안나올 수도 있나요? 처음 붙인 항체와 stripping 후 붙인 항체가 다르긴 한데, 이런 경우 두번째 antibody가 잘 결합을 못했다고 해야 하나요?    원래 stripping 후에 잘 붙었었는데 갑자기 이러니깐 난감하네요,, 아니면 제대로 stripping이 이루어지지 않아서 안 붙을수도 있나요? sample이 없어서 stripping을 해야 하는 상황입니다 ㅜㅜ
회원작성글 쿵쿠따리쿵쿠따  |  2022.09.01
Q. 골격근 웨스턴 house keeping gene
mouse skeletal muscle protein을 웨스턴할 때 house keeping gene으로 beta-tubulin을 보는 이유가 무엇인가요? beta-actin을 보면 안되나요?
회원작성글 별헤는밥  |  2022.08.31
Q. 웨스턴 로딩시 오래했을 때
웨스턴 로딩할 때 오래 로딩하면 어떻게 되나요? 마커가 아래로 빠지게 되는 경우 위에 남아있는 마커 영역의 단백질은 남아있는 건가요?
회원작성글 별헤는밥  |  2022.08.30
Q. western blot 실험 중인데 size marker 발현이 이상해요... 첨부파일
안녕하세요! western blot size marker 궁금한 점이 있습니다!! 현재 SH-SY5Y cell로 p-mtor, mtor western blot 진행 중입니다. (조건은 6% gel, 80V로 천천히 Loading, transfer 진행 시 차갑게 세팅하여 진행하였습니다.)   다름이 아니라 결과 확인하면 size marker가 두껍고 진하게 뭉쳐있게 나옵니다..  size marker는 오염이 되지 않고 다른 western할 때는 예쁘게 잘 나옵니다. 이런 경험 있으신 분들 계실까요,,?ㅠㅠ 방법을 알고 계시는 고수분들 도움 주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 ㄹㄹ  |  2022.08.30
Q. 항체 선택 관련해서 고수 선생님들 조언 부탁드립니다. 첨부파일
안녕하세요.   오늘도 선배 없이 혼자 도전 속에 살고 있는 대학원생입니다.   우선 제가 찾고 있는 항체는 mouse androgen receptor라는 항체입니다.   https://www.biossusa.com/products/bs-0118r   이 주소를 봐주시면 감사하겠습니다.   제가 궁금한 부분은 androgen receptor라는 단백질은 제가 알기론 약 100 kda 이상인 것으로 알고 있는데, 위 링크의 androgen receptor 항체의 경우 약 48 kda 쯤에 밴드가 나타나는 것을 볼 수 있습니다.   그렇다면, 제가 알고 있는, 그리고 가장 많이 인식 되는 100 kda 이상이 이 단백질의 진짜 kda인지, 아니면 저 위의 링크 항체처럼 48 kda에 밴드가 떠도 신뢰할 수 있는 androgen receptor 1차 항체인지...  궁금합니다.   가끔 항체 서칭하다보면 이런 경우가 종종 있는데... 고수 분들께서는 어떻게 항체를 찾으시는지 저런 정보를 접했을 때, 어떻게 바라보시는지 관점이 궁금합니다.   깊은 조언 부탁드립니다.    읽어봐주셔서 감사합니다.  
회원작성글 kodo2001  |  2022.08.29
Q. westen blot background가 검정색 첨부파일
두 well에 target protein antibody를 처리하고 본 사진입니다 actin으로 했을 때는 배경이 흰색에 band가 검정색으로 나왔는데 여기서는 배경이 훨씬 어둡고 검은색 띠 같은 게 살짝 보이긴 하는데 저 부분이 target protein이 맞나요..? background가 왜 어둡게 나오는지도 궁금해요 ㅜㅜ
회원작성글 징이삼  |  2022.08.28
Q. 단백질 western blot 도와주세요 ㅜㅜ 첨부파일
두 개의 well에 loading한 건데 actin 결과가 이렇게 겹쳐서 나온 거는 뭐가 잘못된 걸까요..ㅜㅜ 그리고 target protein 2개는 아예 band가 안 나왔어요..ㅠ   actin은 저렇게 선명하고 나오고 다른 단백질은 안 나왔다는 건 뭐가 문제가 있었던 걸까요..ㅠㅠ
회원작성글 징이삼  |  2022.08.28
이전  01 02 03 04 05 06 07 08 9 10  다음
실험 회원 등급이란?
실험Q&A 회원등급안내
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크 광고