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Ni-NTA 컬럼을 이용한 단백질 결합에 관한 문제 |
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 윤시 | 2010.02.02 10:09 |
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안녕하세요
저는 석사과정에 있는 학생입니다. 저는Hyperthermophilic archaeon Thermococcus
kodakarensis KOD1 으로 부터의 단백질인 tk1488을 pET28(a) 벡터에 실었습니다.
한동안 -80도에서 보관을 하다가(그전에 sequence 확인은 하였습니다.) 다시 꺼내서
cell을 키운후에 expression을 하였는데, ni-nta 컬럼에 내렸는데 단백질 결합을 하지
않네요. cell은 LB배지에서 키웠고(37도) IPTG 1M stock을 1/1000 으로 희석 시켜서 사용하
였습니다. 그리고 kana 50ug/ml로(최종 농도) 사용하였구요.
ni-nta는 regeneration시켜서 사용했는데 unbind 부분에서 다 딸려 나와버리더 군요....
lysis buff( KCl 300mM, KH2PO4 50mM, imidazol 5mM), elution buff(KCl 300mM, KH2PO4 50mM,
imidazol 250mM)을 사용해서 분리를 하였습니다.
5mM lysis buff로 내렸을때 희미한 band만 나올뿐 높아진 imidazol 농도에는 band가 나오지
않네요... 모두 unbind에서 나와버리고....
혹시 저와 같은 경우를 경헙하셨거나 해결책을 아시는 분이면 조언을 해주시면
감사하겠습니다. |
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조건부터 잡고 하세요.
wash 매 과정마다 fraction 을 save 하고
elution 또한 농도별로 준비해서 fraction 별로 다 save 하세요.
그리고 gel 걸어서 어느 농도에서 떨어지는지를 확인하세요.
wash 과정에서 떨어진다면 wash 시 사용하는 imada 농도를 줄여야겠죠.
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윤시 | 2010.02.02
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네~~^^
조건은 5mM, 30mM, 50mM, 100mM, 250mM imidazol 로 나누어서 했구요....
각각 elution 후에 확인해 보니까 5mM에서 희미하게 bind된 것 외에 밴드는 없고요
unbind 에서만 제 protein이 확인이 되었습니다~~.. |
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님의 단백질이 아주 soluble 한가 보네요...
통상 그리 높은 온도에서 키운애들이...soluble로 잘 안갈텐데 말이죠...;;
단백질이 제대로 recombination되어서 벡터에 들어가서 hexa histidine tag를 갖는데...
Ni-NTA 컬럼에 안 붙는다...
어떤 상황일까요?
보통 solubility test를 안했을때...sonic으로 깨준 셀치 insoluble한 경우...
붙을 애가 없는 경우죠!
- 보통 이때 셀 culture 조건..특히 온도가 영향을 주죠..
(애들을 천천히 자라게 하여..급히 insouble로 떨어지는것을 막는다는데...)
혹은 IPTG농도를 줄여서..역시 induction이 천천히 되게 하는 효과!
헌데...이렇게 하여..단백질이 soluble하게 존재하는데도...안붙는건..
- HIS tag 노출의 문제.. - 단백질의 folding 문제..
이건 그럴 가능성은 있다는데..솔직히 잘 모르겠습니다.
(아직..심적으로 그리 믿겠지만..실제 본적이 없어서요...ㅎ)
- 컬럼 regeneration...혹은 버퍼 문제?
음...저녁시간에 후딱 적다보니..조금 두서없네요...
천천히 실험 과정을 되돌아 보시면...
쉽게 해결될것입니다~ 그럼 수고하세요~^^ |
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 TX | 2010.02.03
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제 생각엔..
지금 쓰고 있는 NTA 컬럼이 오랫동안 쓰면서 regeneration을 반복한 경우라면,
NTA 컬럼을 새것으로 교체해서 해보시는 것이 좋을듯 합니다..
그리고 참고로 hyperthermophile protein인 경우, cell lysis후에 한번 heat 처리한 후에 NTA 로 가시는 것도 좋습니다.. |
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윤시 | 2010.02.03
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답변을 주신 모든 분들에게 진심으로 감사드립니다.(여러분은 저의 영웅^^ㅋㅋ)
제가 여러가지 조건으로 해 보았는데 컬럼상의 문제가 제일 컸던 것 같았네요
우선 컬럼을 새것으로 교체한 후에 다시 내려 보았는데 binding을 하였습니다.
^^
하지만 imidazol 30mM에서 다 떨어져 버리네요~~ 다행인건 다른 밴드가 없어서 분리는
하였지만 낮은 농도에서 떨어지는 것이 좀 찝찝하네요~~~
his tag protein이 약하게 결합 되어서 그런건가요??
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