글쎄요...
정확히는 원인 파악은 여러방면으로 해봐야겠지만...

1차적으로..기본적인 original 은 sequence가 확실한것이지요??;;
(당연히 그렇겠지만요... 가끔은 이걸 전혀 의심의 여지없이..하는 사람이 있기에..)

quick mutagenesis 를 통해 증폭되며 mutation이 만들어지는 원리는 숙지 하셨겠지요?

1개를 완성해 놓고서..-sequence 확인하고..
다음번 자리의 것을 또 그것을 template로 사용하면서..거듭해 만들어 가야죠..

헌데, mutation위치가 혹시라도 primer가 overlap되는 부분은 아닌지 확인해야죠!
보통 mutatnt 만들때  primer는 30mer 정도로 조금 길게 만들어 주다보니...
아미노산이 인근에 위치하게 되면... 잘 안들러 붙을 가능성이 있을듯 합니다.

그리고..프라이머를 동시에 다 집어 넣는다....ㅡㅡ^
이거는 좀... 물론 각각에 들러 붙었다 칩시다.
헌데...한번 들러붙은애들이 다시 갈라져 증폭될때....
cycle이 증가 될수록 어떤 경우의 수로..어떻게 붙어 나갈지.........
고민해 보신다면..답이 나올듯 합니다.

extension 시간은 template의 길이에 맞춰..사용하시는 pFU 효소 활성 및 설명서에
있을듯합니다. 저는 보통 1kb당 2분 정도씩 설정 합니다.

그럼 성공을 바랍니다~~^^