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레벨2
%자 가는거야%
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10.03.22 14:11
one step 만으로 99% 순도 정제는 안될겁니다.
cell, invivo 실험에서 순도도 중요하지만 endotoxin은 문제가 안되는지 알아 보셔야 할겁니다.
taq은 어떠한것을 사용하시든 비슷하지 싶네요. cloning 을 하실거라면 하시기 편한걸로 진행하시면 될거같네요.
GST, His tag 등 종류가 많으니까요.
단백질 정제의 기본 지식이 없으신듯 한데 먼저 간단히 정제 공정 및 resin, 단백질 PI, 등에 대해서 공부를 하시고 진행하시는게 시간 낭비 않하시는 길일겁니다.
간단히 몇가지만 말씀드리면
1. cloning desin - 단백질을 soluble or insoluble로 만들것인지
아니면 Inclusion body 형태로 만들어 진행할것인
taging은 무엇으로 하며 그에따른 vector, Host 결정
2. 배양 조건 확립 - 단백질이 잘 발현되는 배양 온도, 시간 등의 확인 실험
3. cell lysis 조건 확립 - lysis 조건에 따라 이후 정제 공정에 영향을 줄수 있음.
4. 정제 전의 전처리 - Ammonium sulfate 처리, pH 처리 등등 여러 방법으로 초기 순도 향상 및 이물질 제거
-- 단백질의 PI를 안다면 pH ppt 방법도 괜찮습니다.
5. 정제 - tag을 하셔도 순도를 더 향상시키기 위해서는 다른 추가적인 방법들이 필요할겁니다. anion, cation, HIC, Heparin resin 등등 여러 방법이 있으니 잘 디자인하시고 방법을 모색하셔야 할겁니다.
관련 단백질의 자료를 paper와 patent에서 많이 찾아보세요.
도움이 되실지 모르겠네요.
성공하세요.
가장 일반적인 방법을 설명드리자면...
GST-fusion인 경우, 99% 이상 순도를 얻으려면, 3단계 정제 단계를 씁니다..
1. GST affinity column
option : GST cleavage 단계
2. ion exchange column
3. gel filtration column
물론 자세한 실험방법은 여기서 설명하기 힘들고, 또 논문을 찾아봐도 자세한 실험방법을 찾을수 없을 겁니다..-.-;.
단백질 정제 처음 하시는 분이 높은 순도의 단백질 정제하기도 힘들구요..
왜냐면 순도 높은 단백질 정제에는 여러가지 노하우가 필요하고, 또 FPLC같은 장치도 필요하기 때문이죠. 이런것을 다 갖춘 실험실과 co-work하시는 방법도 있습니다...