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배양 후 formaldehyde 처리와 glycine 처리
permeabilization 후 blocking
1st, 2nd antibody 처리 후 mounting, sealing 과정을 거쳐야 합니다
구체적인 내용은 protocol을 한번 찾아보세요
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신바람이박사
(비회원)
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10.03.29 03:33
cell 을 적정시간 키우신후 PFA로 fixation 시킨후 washing단계까지 well-plate안에서 다합니다
전 0.5% tritonX-100로 5분하고 washing두번한후 3% BSA/PBS로 blocking 30분정도 합니다. 그리고 1st antibody incubation할때는 antibody를 30-40 ul정도 파라필름에 떨어뜨린후needle과 핀셋을 이용해서 coverslip을 꺼내서 antibody drop위에 엎어놓고 incubation시키세요
혹시 antibody아낄필요 없으시면 그냥 well plate에 antibody solution넣고 incubation해도 되요
그후 washing은 다시 well plate에서 하시고 (다시 coverslip을 핀셋으로 well에 넣어야겠죠)
2nd antibody는 제 경우에 그냥 well 에 넣어서 incubation합니다. 24-well plate경우 300 -400 ul/well 정도로 넣고요. 이후 다시 washing하시고 DAPI염색필요하시면 2분정도하신후 마지막에 DW로 washing한번하시고 mounting media를 5 ul정도 slide glass에 떨어뜨리세요 [이때 mounting media가 끈적해서 버블이 생길수있는데 안생기게 주의하세요] 핀셋을 이용해서 다시 coverslip을 꺼내서 mountion media 위에 엎어놓고 상온에서 말리신후에 4c 냉장고에 보관하시면되요. 핀셋으로 coverslip다룰때 깨질수도 있으니 조심하세요~