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 전체 > Cell Biology > Transfection
조회 13575  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 ampicillin 첨가시..그리고 transfection..
왕초보  | 2006.08.25 19:31
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
밑에 글 답변 달아 주신 분 감사합니다..
그런데 원하는 답이 아니라 다시 한번 질문을 드립니다..
제가 알고 있는 지식은 LB plate를 만들 때는(agar 첨가) 만든 LB broth를 따뜻할 정도로 식혀서 ampicillin을 첨가한다는 것입니다..이유도 알구요..
그런데 중요한 건 LB broth 자체로 사용할 때입니다.(agar 미첨가)
저흰 Test Tube에 3ml씩 분주해 놓고 사용합니다..
그런데 실험실 선배들은 그 3ml에 나중에 사용할 때 ampicillin을 첨가한다고 그러더군요..
그래서 제가 3ml씩 분주 하기 전, 즉 큰 플라스크에 모든 broth가 담겨 있는 상태에서 ampicillin을 넣고 3ml씩 분주하는 건 안 되냐고 물었습니다..
그랬더니 이유가 있다고 말씀하시더군요..
plate랑 broth랑 단지 agar가 들어가고 안 들어가고 차인데..왜 broth는 굳이 그래야 하는지 이해가 안 됩니다..
제가 생각한 것이 틀린건가요??
밑에 글에 리플 달아 놓은 분이 말씀하신 것처럼 다른 antibiotics를 첨가하지도 않습니다..

그리고 하나 더 질문하겠습니다..

transfection 하기 하루 전날 cell pass를 한다고 알고 있습니다..
왜 그런거죠??
프로토콜을 읽어 보니 density 때문이라고 되어 있던데..
일반 culture하는 dish도 그 정도의 density는 되는 걸로 알고 있습니다..
cell cycle을 맞추기 위해서 그런건가요??

초보적인 질문이지만..기초가 탄탄해야 한다고 생각합니다..
검색을 해 봐도 마땅한 답이 없길래..
답변 좀 부탁드립니다..
#ampicillin
 
# transfection
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리spooky  |  2006.08.25   
글쎄요..
제 생각으로는 필요에 따라서 그런 것 같네요.
transformation 할 때 보통 cloning 경우에 (아니면 바이러스 제작시에도)
LB broth (항생제 없는 것)로 1 시간정도 incubation 하는 시간이 있죠.
이런 경우에는 항생제 안들어간 LB broth 를 쓰는데,
나중에 cloning 하고 나서나, 특정 벡터를 가진 bacteria 를 키울 때는
이런 broth에 ampicillin 이나 kanamycine 을 첨가해서 키우죠.

이런 것을 보면 broth를 한번 만들어서 그냥 아무 항생제만 넣기는 효율면에서
좋지 않고.
(저는 보통 실험실에서 broth를 4-5 개 정도 플라스크에 만들어 놓고 다 같이 썼었기 때문에..)
그리고 기껏 anitbiotics 넣어놨는데 broth가 오염되는 경우가 많습니다.

하지만 plate는 만들어서 굳혀서 냉장보관 하면
아주아주 오랫동안 쓰지 않고서야 괜찮으니까요.

그냥 제 사견입니다.
골드문트  |  2006.08.25    
제가 알기론 ampicillin 같은 항생제는 온도에 민감하므로 뜨거울 때 넣으면 않되는 것으로 알고 있습니다. 또한 그 효과는 24시간 정도 인것으로 알고 있는데..
쓸때마다 Antibiotics를 넣는 것은 그 효과를 고려한 것이 아닌가 싶습니다..
실제.. 3ml에서 접종 후 배양을 하고 나서 24시간 이상이 지나면 그 때 부터,
항생제의 의미가 없다고 배운것 같습니다..
꽃개구리juno  |  2006.08.26   
Stability 때문입니다.
High concentration의 ampicilin solution이나 agar plate는 어느정도 stability가 유지되지만 LB에 dilution된 ampicilin은 상온에서는 금방깨집니다.
4도에서 보관하시는 분도 보긴 했는데 그렇게 보관하더래도 그리 오래가지 못하는 걸로 알고 있습니다.
올챙이김현민  |  2006.08.26   
윗분 말씀처럼 ampicillin 항생제는 하루 이상지나면 역가가 많이 떨어집니다. 액체 배지로 미리 첨가해두면 낮은 농도로 있기때문에 stabilty도 많이 떨어지구요. 보통 lb는 멸균한후에 상온에서 둔상태로 사용직전에 항생제를 넣습니다. 상온에서 항생제가 없는 상태로 있기때문에 media가 오염되지 않았는지 확인할수도 있겠죠.
엘피스  |  2006.08.27    
첫번째 질문에 대해서는 많은 분들이 의견을 주셨기 때문에.....

제가 사용하는 방법하나를 소개하자면 저는 mini-culture시 test tube를 사용하지 않습니다. 그냥 멸균된 1.5ml eppendorf tube를 사용하는데 그 이유는 test tube를 wash하는 것이 귀찮아서 입니다. cell이 자라거나 또는 DNA prep을 하는데 아무 문제가 없고 심지어 induction test과정도 eppendorf tube에서 하고 있습니다. 50ml Conical tube에 plain LB를 넣고 여기에 ampicillin을 dilution한 후 1ml씩 prep할 colony의 수에 맞게 eppendorf tube에 분주한 후 바로 사용합니다. 물론 plain media는 수리터를 만들어 4C에 보관하고 사용합니다. 요즘은 96well이나 384 well에서도 E.coli를 키워 DNA를 prep하는 시대이기 때문에 사실 1ml culture도 많은 편이죠.

두번째에 대해선 cell growth state를 맞춰주기 위함입니다. initaial stage나 cell growth가 saturation된 lag stage보다는 log phase상태에서 유전자를 받아들이는 효율이 높기 때문입니다. 이는 E.coli도 마찬가지입니다.
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