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His tag protein purification 에 대한 질문입니다. |
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his-tag | 2011.01.19 07:47
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답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의) |
제가 his tag protein 을 purification 할려고 하는데요. 좀 문제가 있어서요.. 우선 secretion 되는 단백질이구요..his-tag 을 n-term 쪽에 달았습니다. 그리고 셀을 키운다음 supernatant 를 모으고 filterization 을 해서 셀을 제거후 protein 을 뽑을려고 합니다. supernatant 에서는 western 으로 단백질이 분비되었다는 것도 확인이 아주 잘 됩니다. (his-tag antibody 사용) 문제는 purification 이 안된다는 겁니다.
Ni-NTA column 을 이용하는데요.. 4oC 에서 인큐베이션을 한시간 동안 한 후에 imidazol 을 이용해서 순수 분리를 할려고 했습니다.. 문제는 제 프로테인이 Ni-NTA column 에 binding 을 안한다는게 문제입니다.. incubation 하고 unbound fraction 모으고 washing step 에서 다 샘플 모으고250mM imidazole 로 elution 을 하는데요.. control 에서는 western 시 밴드가 아주 잘나오구요..unbound fraction 에서도 밴드가 아주 잘나오는데요..elution 에서는 안나옵니다.
binding 하기 전에 supernantant 는 desalting spin column (cut off 7kDa) 이용하여 desalting 을 하였습다. 세균의 media 에서 나온 물질들이나 세균에서 분비된 ion 이나 small molecule 이 binding 에 영향을 줄것 같아서..ion과 small molecule 을 제거하려고 desalting column 을 사용하였습니다..Column의 성능은 괜찮습니다..MS/MS 실험할때 쓰는것으로 95% 이상 desalting 기능을 보여주고 MS/MS 실험시 문제가 없었습니다.
Supernatant 를 사용하기 때문에 binding buffer 를 5x 로 만들어서 buffer 와 sample 를 1:4 비율로 혼합후 binding 시키구요..pH 가 틀려 질지도 모르기때문에 항상 혼합후 pH를 확인 했습니다.
제가 해본 방법은
1) Denature condition (urea 로도 해봤고 샘플를 boiling 해서도 해봤습니다) (native form 에서는 his epitope 가 안쪽으로 숨어서 돌출이 안될 수 도 있을꺼 같아서요).. 해봤는데요 마찬가지로 binding 이 안됩니다. undound fraction 에서는 band 가 잘 보이구요..
2) 혹시 binding 한것이 안떨어 질지도 몰라서 elution buffer 에다가 EDTA 나 SDS 도 넣어봤고.. boiling 도 해봤습니다... eluate 에서 역시 detection 안되었습니다.
3) incubation buffer 를 바꿔 보았습니다...pH를 6.8 과 8.0 두가지로 해봤고. buffer도 PBS랑 Tris 다 써봤는데요..binding 이 역시 안되었습니다.
4) c-term 으로 바꿔 해봤는데 역시 purification 이 안됩니다.
5) affinity 가 약할 지도 몰라서 binding buffer 에 imidazol 이 없는 것으로도 해보았습니다.
6) Ni-NTA column 의 문제일지 몰라서 다른 랩에서 빌려와서 (그랩에서 잘 쓰고 있는 것으로qiagen과 GE) 꺼 사용 해봤는데 역시 실패 했습니다.
7) binding incubation 시간을 늘려 봤습니다. 0.5, 1, 2, o/n..모두 실패 했습니다.
위의 모든 case 에서요 unbound fraction 에서는 protein 이 detection 이 잘 되었습니다.. 하지만 purification 이 안되었습니다.. protein의 stability 나 his-tag 에는 아주 커다란 문제는 없는 것 같습니다. (Unbound fraction 에서는 detection 이 잘 되기 때문에요..)그래서 내린 결론이 Ni-NTA chelating 즉 binding 에 문제가 있는 것 같은데요. 혹시 도움을 주실 수 있나 해서요..똑똑한 브릭 여러분들의 의견을 기다리겠습니다.
긴글 읽어 주셔서 감사합니다..
모두 실험 대박!! |
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#his-tag #purification |
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본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다. |
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나름 다양한 test흘 해보신듯 해서...답변이 도움이 될런지 모르겠습니다.
1. binding이 안된다는 것이 가장 큰 문제인듯 한데요...
(더 이상한건 왠만해선 denature 조건에서 조차 안 붙을수가 없죠!!)
그리고 C-term tag까지 해도 안된다는 것은.........
=> 저라면 이 경우엔 곧장 tag를 변경 하겠습니다만!!
(GEX, GST tag 계열로~)
2. 혹 웨스턴으로 확인이 아닌..단순한 SDS-PAGE를 통해...
깨진 셀의 상등액을 원심분리 돌리기 전 후 샘플을 비교해서 확인해 보셨나요?
웨스턴으로 specific하게 미량 존재하는 것을 확인한것 보다는..
단순히 셀 깨져 solubi;lity가 얼마나 있는지 부터 확인이!!
(즉. binding이 안되는게 아니라... 붙을 단백질이 soluble에 제대로 없는게 아닐까..싶은)
3. 혹 lysis buffer 조성이 어떻게 되는지요?
셀 깨고..레진에 붙일때 조성이 잘못된건 아닐까 싶은건....
4. 요즘 여러 회사에서 Ni 말고...다른 2가 양이온 코발트 같은...
더 친화력 있다는 제품 만들어 판매합니다. 샘플을 요청해 test해보는것도...
(제 경험상...아직 그리 효과있는것은 없었지만... case by case...!!^^)
이상 허접한 답변이었습니다.
실험 결과 잘 나오길 바랍니다~!^^ |
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우선 답변 달아 주셔서 감사하구요..
GST 계열로 생각을 해보았는데요..제 프로테인 사이즈가 mature form 20kda 밖에 안되고.. 이것이 secretion channel 로 분비되기 때문에 되도록이면 tag 의 사이즈가 작은 것으로 할려고 하고 있습니다. 그리고 c-term 보다는 n-term 이 좀 더 stable 해서 n-term 을 주로 쓰는데 n-term도 맨 앞에 다는게 아니라 secretion signal peptide 와 mature form 사이의 중간 지점에 넣어야 되는 거라서요...signal peptide 는 secretion 후 잘려서 나가는 거 까지 MS/MS 로 확인 하였거든요..
그리고 western 시 단순히 가느다란 밴드가 나오는 수준이 아니라요.. western 을 하면 거의 새끼 손톱만하게 두껍게 detection 이 됩니다.. 그리고 셀을 깨서 쓰는게 아니라서 셀 밖으로 분비되어진 protein 을 purification 해야 되서요...secretion 과정에서 PTM 이 일어나서 cell lysate 가지고는 다음 스텝의 실험을 못하거든요..media 로 secretion 이 되기때문에 solubility 는 문제가 없을 거 같다고 생각되어 지거든요...
그리고 buffer phosphate buffer 쓰고 있구요..기본적으로 qiagene 에서 나온 프로토콜을 가지고 쓰고 있습니다.. 그리고 제가 secretion 된 단백질을 사용하기 때문에 박테리아도 rich media 에서게 아니라 조성을 확실히 알 수 있고 쓸데 없는게 들어가 있지 않고 박테리아 크는데만 반드시 필요한 요소가 들어가 있는 minimal media 를 씁니다...
현재 말씀해 주신 test kit 을 오더 했습니다..혹시 몰라서 Ni, Co, Zc 써볼려구요.
답변 달아 주셔서 다시한번 감사드립니다.
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 TX | 2011.01.21
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일단 기본적인 사항이지만 한번 확인해볼 사항은...
(1) binding buffer에 DTT나 bME 같은 reducing agent가 들어가진 않았는지요? 너무 많이 들어가면 binding이 약해집니다.
(2) 컬럼은 사용하기 전에 충분한 량의 binding buffer로 equililbrium시켰는지요?
(3) positive control 샘플은 확인하셨는지요??
님의 단백질이 secretion되는 경우, ammonium sulfate precipitation으로 protein을 모으고, 그 다음 binding buffer에 다시 녹인후, NTA에 붙이는 방법도 있습니다.
만약 어떤 알수 없는 문제 때문에 His tag affinity가 계속 실패한다면, NTA대신 ion exchange 컬럼 같은 것으로 바꿔서 할수도 있을겁니다.
성공하시길... |
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답변해 주셔서 감사합니다..
우선 binding buffer 에는 reducing agent 는 안들어 갑니다.. phosphate 랑 NaCl 정도만 들어가구요... 요즘은 들어서는 imidazol 도 안 넣고 하고 있습니다.. 최소한이라도 붙는걸 보려구요..
컬럼은 충분히 equililbrium 을 하고 있습니다... Resin volume 을 열배로 세번씩 하고 있구요...
positive control 을 다른 protein 에 his tag 붙은걸 의미하신다면 물론 컨펌했구요... 다른 protein 은 잘 붙습니다..
ion exchange chromatography 도 해보는데요...이건 purifty 가 안좋아서요. 제가 원하는 정도의 purity 를 얻지를 못하겠네요...그래서 classical size excursion chromatography 와 ion exchange 를 병행해서 해볼려고 하는데요.. 이건 시간도 많이 걸리고 그래서 되도록이면 NTA 컬럼을 사용할려구요..
의견 주셔서 감사합니다.
의견 주셔서 감사합니다... |
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anti-6X his antibody를 이용한 western이 잘 된다고 하면 항체를 이용해서 정제해도 되지 않나요??
Protein A를 써보시는 것도...
column에 binding이 않되는 이유는 모르겠으나...
여러방법을 써보셨는데 않되면 차선책으로 다른 방법을 써서라도 정제를 하심이 어떨지요.. |
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