저도 똑같은 일 때문에 고생한게 생각납니다.

저는 님께서 해결책으로 해보신 정제시 wash buffer의 imidazol 농도의 변화를 통해 조건을 잡아서 해결을 보았습니다.

그리고 저역시 과발현이 목적이었는데 이놈의 것은 SD와 ATG의 거리부터 시작해서 별별짓을 해도 많이 발현을 안하더라고요...그래서 결국은 왕창 정제한 후에 농축을 했습니다.

행운을 빕니다. 정제라는게 정말 쉬운것이 아닙니다. affinity를 이용한 정제에서 비일비제하게 일어나는 일입니다. 하나하나 조건을 잡아 보세요.

1. Codon Usage를 체크해 보세요. (Google 등에서 검색해 보면 amino acid sequence를 붙여넣으면 codon usage를 체크해 주는 툴들을 찾을 수 있습니다) 만약 E.coli에서 극히 적은 빈도로 사용되는 AGA/AGA (Arginine), AUA(isoleucine), CUA (leucine) 등과 같은 Codon이 많이 존재한다면 해당하는 rare codon에 해당하는 tRNA 유전자가 별도의 plasmid에서 발현되는 BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (Stratagene) 이나 Rosetta (DE3) (Novagene) 과 같은 E.coli strain에서 발현하면 발현양이 증가할 ''수도'' 있습니다.

2. 사실 Ni-NTA의 경우에는 발현양이 약할 경우 잡다한 것들이 원래 많이 붙습니다. 이런 경우에 Washing 시의 Imidazole 농도를 높이거나 Step Gradient (20mM Imidazole, 50mM, 100mM 이런식으로) 을 주어서 Fraction을 받는다든지, 아니면 Gradient Mixer 등을 이용하여 Imidazole Gradient 를 준다든지 여러가지 방법이 있습니다만, 그래도 Ni-NTA 만으로 발현양이 낮을때 Purity를 높이는데는 한계가 있습니다.

3. 이 경우에는 Culture volume 을 늘리고, Ni-NTA 를 거친 후 다른 Chromatography (ion-exchange, gel filtration 등) 를 하는 것 이외에 확실한 방법은 없습니다. Protein Works을 많이 하는 실험실이 있다면 이 정도의 기본적인 컬럼웍은 할 수 있겠지요.

저도 codon usage의 문제가 아닐까 하는 생각이 듭니다.
이런 경우 유전자를 E. coli에서 많이 존재하는 codon으로 다 뜯어 고치거나 host를 바꾸는 것이 해결책이 될텐데 codon을 일일이 뜯어 고치는 것도 쉽지 않고 다른 host system을 구축하기도 쉽지 않으신 상황인 것 같군요.

혹은 E. coli의 rare codon 문제를 해결하기 위한 strain도 있으니 그걸 한번 사용하시던지요.

일단 codon usage를 check하시고 정말 그것이 문제라면 system을 바꾸시는것이 방법입니다.
현재의 system으로 계속 하시는 것 보다는요.

우선 답변에 너무 감사드리구요. Juno님의 첨부파일이 열리지 않는데, 무슨 내용인지 알 수 있을까요? 아니면 메일로 보내주실 수 있으신지요? 메일 주소는 crom0242@naver.com 입니다. 감사합니다.