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positive control은 원래 actin에서 나오지 않는건가요??
RNA sample에서 밴드가 보여도 cDNA랑 비슷하지만 않으면 컨텀이여도 넘어갈 수 있을것 같음
어떤 sample인지는 모르겠지만 RNA extraction을 했을때 100% 순수한 RNA만 얻는것도 힘들고,
원래 PCR이 어떤 data가 나올지 변수가 많은 실험이라...
혹시 RNA 양은 얼만큼 넣고 PCR 하셨나요
답변 감사합니다.
베타 액틴 실험시 에는 cycle 을 줄여 보려고 합니다.
cDNA 보다는 훨씬 약하게 발현 되었었고요
하루 지나서 생각해 보니 이럴 수도 있겠구나 생각이 드네요
RNA 는 농도상관 없이 1ul 넣고 pcr 하였습니다.
cDNA 만들 때는 1ug 맞추어서 볼륨 만들었고요
저도 아직 초보이지만 제 생각을 얘기해보겠습니다.
RNA에서 band가 나왔다고 하셨는데
예를들어, RT과정에서 RNA를 1ug을 사용하였고 그 양이 2ul였다 가정한다면
(저의 protocol을 기준으로)buffer를 넣고 DW로 total 20ul를 만듭니다.
즉 RNA의 농도는 1/10이 되겠지요
이 상태에서 PCR을 하기 위해 위에서 만든 cDNA중에 2ul을 넣습니다.
기존RNA를 넣고 PCR하려고 1ul넣은 sample도 만듭니다.
위의 두 sample의 농도 차이는 생각보다 크지요, 당연히 band가 나올 수 밖에 없다고 봅니다
저도 이런 실수로 계속 RNA가 contamination됬다고 걱정했었는데, 적어도 30cycle 이상은 돌리는데 product에서 저정도의 농도에서 안나온다는게 더 이상하다고 생각되네요 ㅎㅎ