A라는 gene이 protein으로 translation되나요?
translation이 된다면 이 gene을 overexpression해 보면 알수 있지요~
하지만 과정이 sequencing하는 거 보다 힘듭니다.
sequencing을 하면 쉽게 알수 있는데 왜 굳이 다른 방법을 이용하려 하시는지요?
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mutation
(비회원)
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12.08.29 19:00
그런가요? 저는 다른 방법이 무엇이 있는지 궁금해서요..
sequencing이 제일 낫군요.. 답변 감사합니다.^^
어느 부위에서 정확히 mutation이 일어났는지 알수 있으시다면.... 예견 가능하시다면....
PCR로 확인 할 수 있지 않을가 생각 드네요
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엘피스바이오텍
(비회원)
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12.08.30 10:42
모든 mutation 은 PCR로 검출이 가능합니다.
Deletion이 있다면 예상부위의 앞뒤로 primer를 짰을때 normal과 비교해 PCR size가 다르게 나올 것입니다.
엘피스바이오텍님께.
모든 mutation은 PCR로 검출이 가능하다고 하셨는데요....
제 지식으로는 정확히 이해가 되지 않아서 그런데....
엘피스님 말처럼 인트론 부위나 엑손부위에 결핍이 있다면 product의 크기가 달리 나올수 있겠지만, 1~3b.p 정도가 결핍된다한다면 PCR product 크기를 눈으로 비교 할수 있나요?
또한, 결핍이 아닌 전위나 single point mutation이라면 PCR만 가지고 확인을 할 수 있는건가요?
항상 sequencing으로만 mutation 확인을 해 왔던 저에게 가르침을 주소서
만약 PCR만 가지고 검출이 가능하다면 저도 그렇게 해보려구요.
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엘피스바이오텍
(비회원)
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12.08.30 15:43
Deletion 된 부위가 크다고 하면 wt와 mut의 PCR size로 구분만 하면 됩니다.
point mutant의 경우에는 방법이 아주 많습니다.
고전적인 sscp방법에서부터 mismatch endonuclease를 이용하는 방법 등등....
제가 주로 사용하는 방법은 Taq의 성질을 이용하는 것입니다.
Proof-reading 기능이 없는 즉 3 to 5' exo기능이 없은 Taq은 primer의 마지막 base가 template와 match되지 않으면 증폭이 되지 않습니다. 즉 wt가 A라고 했을 때 mutant가 G이면 primer의 마지막 base를 C로 만들면 wt은 증폭이 되지 않고 mutant만 일치하여 증폭이 됩니다. 아주 간단한 방법입니다. Chip 을 이용한 multi analysis에도 사용되는 방법입니다.
이밖에도 T7 endonuclease나 CEL 1 endonuclease처럼 mismatch되는 dsDNA부분만을 절단하는 효소를 사용하면 PCR mix를 wt control과 섞어 reannealing시킨 후 효소로 자르면 잘리는 유무에 따라 mutation여부를 간단히 확인할 수 있습니다.
물론 돈이 많아 확실히 하고자 한다면 sequencing만한 방법이 없습니다.
하지만 요즘은 real-time이 대세다 보니 real-time으로 HTS를 하려는 시도가 많아지고 있습니다. 반응의 원리와 효소의 특성을 좀만 들여다 보면 아주 많은 새로운 방법들이 아직 미개척으로 남아있습니다.