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vector amplification |
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vector amp | 2012.12.31 15:13
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답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의) |
안녕하세요! 질문이 있어서 이렇게 글을 씁니다
Novagen pET28 a-c vector를 주문하여 사용하기전에 이 벡터를 좀 불려놓으려합니다.
프로토컬을 찾아봤더니
벡터 1ug+ com cell 100ul 를 transfomation 과정(아이스 5분-42도 30초-아이스 2분- SOC 1ml 1시간 배양)을 거쳐 LB (+항생제) 플레이트에 스프레딩하여 콜로니를 LB에 접종하고,
plasmid DNA kit를 이용하여 뽑아 사용하면 된다고 했는데요.
이 프로토컬을 사용하여 벡터를 뽑는게 맞아요?
DNA를 뽑은 후에 엔자임 컷하여 전기영동을 걸었는데
투밴드가 떠서요 ㅠㅠㅠ
이 벡터의 사이즈에 맞게 밴드가 뜨긴 했는데 그 위로 밴드가 하나 더 있습니다 ㅠㅠㅠㅠ
혹이 이 밴드를 gel extraction 하여 써야되는 건가요? |
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 genyx | 2012.12.31
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Transformation 할 때 vector DNA를 1ug 사용하셨다는거 보니까 제한효소 처리할 때도 DNA를 엄청 많이 때려 넣으셨을 것 같은 생각이 드네요. 위에 뜬 밴드는 안 잘린 DNA 같아요. DNA양을 줄이시던지 제한효소 양을 늘려서 다시 반응시켜 보세요. 짤릴 겁니다. 아마도. |
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Calli | 2012.12.31
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Gel 사진을 보면 좋겠는데 안잘린 밴드는 아래에 나오는게 정상이지 않을까요? 위에있는거면 Prep할때 Cell 상태가 안좋았다는걸로 여겨지네요. DNA Cut하고 왠만하면 젤 잘라서 extraction합니다. 프렙이 깔끔하고 실험하기 귀찮으면 mini prep kit으로 그냥 내려버려도 되긴하지만.. |
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Calli | 2012.12.31
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Vector불리는것 치고는 양이 많네요. 10ng에 컴셀 50ul에 LB는 400ul정도하시고 SOC말고 그냥 LB로 해도 되긴합니다. 어차피 콜로니만 뜨면 되니까요. pET 시리즈가 DH5a에서 양이 좀 적게 나오니 불릴때 미디나 맥시로 하시던지요. |
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genyx | 2012.12.31
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Calli님// 아래에 나오는게 맞네요. super coil form은 보통 원사이즈의 1/2보다 약간 윗쪽에 뜨니까.. 제가 착각 했어요~ |
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