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 전체 > Immunology > ELISA
조회 7730  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 <급> direct ELISA 처음 하는데요...질문~
direct ELISA  | 2007.03.20 10:01
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
DIRECT ELISA 는 처음이라...몇가지 여쭤봅니다~

검색해보니 아래와 같은 포로토콜이 일반적이던데요...

1. Dilute the antigen to a final concentration of 20 μg/ml in PBS. Coat the wells of a PVC microtiter plate with the antigen by pipeting 50 μl of the antigen dilution per well.

2.
3.
...

뒷부분은 다 알겠는데 1번이 이해가 잘 안되네요.

antigen 이라는 것은 보고자 하는 protein 이 들어있는 sample 을 말하는 것 맞나요?

그렇다면 그 soup 안에 들어있는 protein 양을 20 ug/ml 로 맞추란 소린지...

양을 어떻게 맞추죠???

그리고 여기서 말하는 PBS 는 coating buffer 같은데...

coating buffer 와 sample 을 같이 넣으면 sample 내 protein 이

plate 에 고정되는 원리인가요?

그리고 준비물로는..

plate, 버퍼 제외하고 필요한 시약중엔 direct EZLISA 용 Ab ,

substrate solution 만 준비하면 되는거 맞나요?

이때 HRP secondary reagent 는 필요없는건가요?

참고로, direct ELISA Ab 정보에 " This antibody can be used at 0.5-1 ug/ml

with the appropriate secondary reagents to detect human X(protein).

라고 적혀있는데 여기서 말하는 적당한 2nd reagent 라는 것이 HRP 를 말하는

것인지 SUBSTRATE SOL. 을 말하는것인지 모르겠네요.

모르는게 많아서....부탁드립니다...^^

#direct ELISA
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
촌놈  |  2007.03.20    
antigen이라고 표현한것은 검출하고자 하는 단백질로 이해하시면 되고요.

만약 단백질이 1mg/ml의 농도로 있고 96well plate 한판을 20ug/ml의 농도로 well당 100ul을 coating해야 한다면..

총 들어가는 coating 버퍼의 양은 약 10ml(넉넉히.. 계산의 용이함을 위해..원래는 96ml이 맞지만요..) 이고 여기에 들어가야 할 단백질의 양은 촐 200ug이므로..
준비된 항원(1mg/ml)에서 200ul를 가져와서 coating버퍼 9.8ml와 합하여 coating하시면 되겠지요.

그리고 질문하신분께서 direct ELISA를 하신다고 하셨습니다.
여기에는 2차 항체가 없이 항원(단백질)과 결합하는 1차 항체에 이미 발색이나 형광등을 나타낼수 있는 효소가 붙어 있는 것을 사용하는 것이지요.
그러므로 준비물은 ELISA용 plate, 단백질, 항체(HRP conjugated), substrate 등..정도가 되겠군요.

참고로 항원(단백질)에 일차 항체를 붙이고 여기에 효소가 붙은 2차 항체를 반응시켜 실험하는 것은 indirect ELISA라고 합니다.
항체를 먼저 coating하고 단백질을 반응시킨후 다시 항체를 붙여 실험하는 sandwich ELISA라고 부릅니다.
direct ELISA  |  2007.03.20    
친절한 답변 감사드립니다.

한가지 궁금한것이 있어서 더 여쭙니다~ ^^

만약 제가 보고자 하는 SAMPLE 수가 5개라면, 즉, 5개의 서로 다른 culture soup 을

가지고 보고자하는 단백질의 각각의 값을 측정해보려 한다면,

5가지 sample 의 soup 안에 들어 있는

protein 농도부터 측정을 해야 하는 것인지요?

그리고, 선생님께서 말하신 대로면, 일단 한가지 sample 로 96 well 전체를 coating

하게되는 결과같은데...제가 뭘 잘못이해한건지요 ㅡ.ㅡ;;;

촌놈  |  2007.03.20    
일단은 서로 다른 배양액이므로 총 단백질 양을 알아야 할 것 같습니다.
그러므로 단백질 정량을 해서 동일한 단백질이 coating 될 수 있도록 해야 할것입니다.

그리고 위의 계산은 제가 계산의 편이를 위해서 한 것 이므로
질문자께서 필요하신 well만큼 계산하시고 coating 하시면 되겠지요.
DOM  |  2007.03.20    
죄송합니다만.. 두분 질문과 답변을 읽어보고 무지 헤깔렸는데..정리가 될것 같습니다
보통 indirect건 direct건 sandwich건 conpetitive건 일단은 항체를 코팅하는것이 일반적인 방법입니다만.. 항원을 코팅한다는것으로보아 그 항원에 반응하는 항체가 샘플내에 얼마나 있는가를 알아보기 위한 방법 같습니다
1. indirect 와 direct는 발색방법에 의한 분류입니다
2. competitive 와 sandwich는 검출 단백질이 가지는 epitope수에 의해 결정됩니다 보통 분자의 크기가 작아 항체와 반응하는 epitope수가 적으면 competitive를 씁니다

결론으로.. 질문하시는분 실험내용은 아마도 이런거 같네요
말씀드린바와 같이 검출하고자하는 대상이 항체인거 같고요.. 따라서 먼저 여기에 결합하는 항원을 우선 일정한 농도로 플레이트에 코팅합니다. 그리고 여기에 스탠다드 항체 또는 샘플내의 항체를 결합시키고 마지막으로 이 항체에 결합하는 enzyme-linked antibody와 substrate를 반응 시킵니다. 그리고 발색 강도를 비교해보면 샘플내의 항체의 존재여부와 농도를 알겠죠?

만약 질문하신분이 ( 검색을 잘못하신 결과로 ) 원래는 항체가 아닌 어떤 단백질을 검출코자 하는것이었다면 제 설명에서 항원-항체를 바꾸면 됩니다. 즉 항체를 균일하게 코팅하고 스탠다드 항원과 샘플항원을 반응시키고 다시 여기에 paired antibody를 반응시키고...

제가 제대로 이해한것이 맞기를 바랍니다 ㅠㅠ
DOM 님.  |  2007.03.20    
먼저 답변 감사드립니다.
저도 예전에 ELISA 를 잠시 했었는데,

예를 들어 TNFa 를 ELISA 한다고 할 때, 간략하게 말씀드리면,
plate 에 capture Ab 로 coating 한 후 blocking 을 하고, standard 와 sample을
반응시킨 후, detection Ab 반응 후, HRP 를 반응시키고, substrate sol. 반응후,
stop sol. 을 반응 후 흡광도를 재었습니다.

이것이 sandwich 라고 부르던데 맞는지 모르겠네요.

그런데 이번에 다시 하려고 했는데 제가 가지고 있는 Ab 가
capture/detection 으로 구분되어 가지고 있는것이 아니라
"Direct ELISA" 용이라고 적혀있으며, Applications 에는 첫 게시물처럼
적혀있었습니다. 이런 방법은 처음해보는지라 모르는게 많아서 찾아봤는데,
결론적으로..틀렸더라도...제가 DIRECT ELISA PROTOCOL 을 찾아보고 정리해본 결과,

plate 에 standard 와 sample 을 반응시켜 coating 한 후 (sample 내에 있는
TNFa 들이 plate 에 붙는가봐요?) blocking 을 하고, direct Ab 를 반응시킨 후,
(data 정보엔 없지만 발색가능한 HRP 같은게 같이 있나봐요?),
substrate sol. 을 반응시키고 stop sol. 을 반응시킨 후 측정하려합니다.

먼가 말이 안되는것 같기도 하고, 맞는것 같기도 하고...
첨이라 잘 모르겠는데....혹시 틀린게 있을까요?

결론은, 제 실험은 님께서 말한 sample 내 항체를 검출하는 것이 아니라
보통 ELISA 목적과 마찬가지로 sample (culture media soup) 에 있는 protein(TNFa)를
보려고 하는 것입니다. 그리고, direct ELISA Ab 하나만 가지고 있다는 겁니다.
DOM  |  2007.03.20    
Antibody에 labeled molecule 이 뭔지 나와있지 않나요?
ALP나 HRP..가끔은 Biotin..

second reagent 는 거기에 맞는 substrate 등이겠죠

보통 analyte의 종류나 크기에 따라 ELISA assay 법 ( sandwich, competitive )등이 결정되고 direct, indirect method에 대해서는..
음 원래는 immunoassay 는 primary antibody에 바로 labeling하는 것이 좋다고 되어있습니다. 하지만 2'' ab를 쓰는 secondary antibody method ( indirect ) 를 주로 이용하는것은 그 편리성 때문입니다. 그 많은 종류의 일차항제를 실험할때마나 labeling하는것은 시간적 비용적으로 낭비입니다. 방법도 쉽지않고 게다가 경우에 따라서 라벨링이 안되는 항체도 있거든요. 또다른 이유는 시그널 증폭인데요 하나의 일차항체에 여러개의 이차항체가 붙는 모습을 떠올리면 이해가 쉽습니다.

TNF-a야 워낙 많이..^^
그래서 enzyme-labeled antibody를 쉽게 구할수 있을거구요. 이런경우라면 말씀드린바와 같이 2nd antibody를 안쓰는 direct method를 쓰는것도 좋겠죠
protocol 1번문구는 일반적인 ELISA protocol의 검색결과라면 뭐 그렇게 예를 들수도 있겠다라고 생각되지만 가지고 계신 항체의 datasheet상에 저렇게 나와 있다면 저도 좀 이해하기 어렵네요. 그러나 제가 생각하기에 정말 antigen을 코팅하라고 하는것은 정제된 항원을 코팅하는것이든 아니면 항원이 포함된 샘플 단백질을 코팅하는것이든 어느쪽이라도말이 안되는건 확실합니다

아마도 우선 일정한 농도의 capture antibody를 코팅하고 거기에 위에서 언급한 농도 ( 솔직히 샘플마다 다르기 때문에 특정 농도로 apply하기보담 multi dilution해서 테스트하는게 맞다고 생각함 )를 기준으로 항원샘플을 반응 시키라는 의미인듯..
어쨌든 지금 가지고 계신 항체와 짝을 이루는 capture antibody도 필요할것 같습니다
물론 스탠다드와 substrate도
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