안녕하세요 현재 대학원에 입학한 석사 1년차입니다....^^
현재 니켈컬럼을 이용하여 단백질을 추출하는 실험을 하고있습니다. 그런데 sonication후 sup을 Binding buffer와 섞은후 컬럼에 내리고 washing 하고 Elution 하면 단백질이 농도가 계속 Binding buffer에 높게 나타납니다.
(Binding에서 loss가 너무커서 elution buffer에서는 나오지 않습니다.)
 sonication부터 하는 과정이랑 buffer condition 올립니다. 조언좀 부탁드릴께요
(벌써 4번째실험인데 정신적 압박이 커지네요 ㅠㅜ) ->제생각으로는 His tag이 니켈 bead에 붙지 않은것 같아요 buffer condition도 확인좀 부탁드립니다 ....  감사합니다.

1) incubation :sample + 1X PBS 10ml, + 10mg/ml lysozyme 250㎕, 30min 4℃(ice)

2) sample volume 30ml (total volume 33ml)

: sonacation한 cell 10ml + 1X PBS 5ml + 1% Sarcosyl 15ml + 10% Triton X-100 3ml

3) incubation : 4℃(ice), 30min

4) centrifugation : cell room 4000rpm, 30min

⇒ 상층액에 protein 있음, pellet(sonication 잘됐으면 검은색)

5) resuspension : pellet + 1X PBS 보관

*Na2HPO4 (50mM) + NaCl (0.5M) →base buffer 가됨

*binding buffer (5mM) 50ml x3, washing buffer (50mM)50ml x3, elution buffer (400mM) x1

→imidazol로 buffer 농도 맞춘다.

1) Binding X 3(sup 섞어서) → Washing X 3 → Elusion 순으로