안녕하세요. 저는 엔지노믹스(www.enzynomics.com)의 연구원 류기혁이라고 합니다.

저도 몇 년 전에 Stratagene 의 Kit를 이용해서 같은 실험을 했었는데요, 콜로니가 적게 나와서 여러번 반복실험을 했던 기억이 나네요.

최근에는 우리가 만든 Pfu-forte를 이용해서 PCR 했더니 원하는 size(6.9 kb)의 밴드가 진하게 나왔고, 우리가 만든 DpnI(곧 출시할 예정)으로 잘라서 TF했더니 콜로니가 많이 나왔고 8개 시퀀싱해서 8개 모두 원하는 mutation이 되었습니다.

우선 꿈꾸는 아이님이 실수한것이 있네요. 95/30sec 16cycle 95/30sec, 55/1min, 68/6min 에서 68/12min 으로 해야합니다. 2min/1kb ^^

그리고 추천해 드리고 싶은 실험방법은요, template DNA를 5배씩 serial dilution 을 해서 PCR을 해서 10ul 정도를 걸어보면 PCR product의 양도 template의 양에 따라 증가 합니다. 그중에서 PCR Product / template 의 값이 높은것을 선택해서 다음의 실험을 하면 됩니다. DpnI 으로 잘라야 할 template 는 적을수록 좋고, 우리가 원하는 최종 산물인 PCR Product는 많을수록 좋으니까요. 대부분의 경우 template DNA 가 10ng 정도일때가 최적이었습니다.

더 궁금한 것이 있으시면 info@enzynomics.com 이나 042-362-3632 로 연락주세요.

키트가 출시가 됐나요?

mutagenesis가 잘된다면 바꿀 의향이 있어서요....

그리구...요즘은 stratagene사에 PCR Cycling이 68도씨 kb당 1min으로 나옵니다..
예전엔 kb당 2min이었지만...^^

애고... 실험이 안되서 무지 힘드네요....

아직은 테스트 중입니다.

우선 Pfu-forte 를 이용해서 PCR 을 해 보시는것도 괜찮을듯하네요...

Dpn I 도 필요하시다면 샘플로 드릴께요.

꼭 답변이 필요한 질문이라면 info@enzynomics.com 으로도 보내주세요.
이곳에만 글을 올이면 제가 못 볼 수 도 있으니까요...