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잉어잉어
(비회원)
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13.12.09 01:34
저도 실험 경험이 많은건 아니지만 혹시 도움이 될까 해서 답변 남겨봅니다.
1. cDNA와 gDNA의 차이라면 intron 유무의 차이로 보셔도 될 것 같습니다. mRNA만을 추출하여(물론 다른 것도 섞이긴 합니다만..) reverse transcription으로 DNA로 만든거니깐, splicing으로 인해 intron이 제거된 형태가 됩니다. (그러나 splicing이 일어나지 않은 DNA도 섞이게 됩니다.)
만약에 primer를 cDNA용으로 만드셨던거라면, splicing junction으로 인해서 해당 primer sequence가 gDNA상에는 존재하지 않을 수 있습니다. 그리고 insert size도 cDNA에서 생각했던 것에 비해 gDNA에서 굉장히 커질 수도 있구요.
이 부분은 UCSC in-silico PCR 이용해서 확인해보시면 편할 것 같습니다.
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
primer sequence를 입력하면 gDNA에서 해당 primer로 PCR이 가능한지 확인 가능합니다.
2. 위의 이유때문에 control 유전자가 안나올 수도 있습니다. 제 경험상 사람 gDNA에서는 primer가 괜찮아보여도 잘 안되는 경우가 있을 수 있습니다. (해당 영역의 컨텐츠에 따라서...) primer를 다르게 해가면서 실험해보시면 좋을 것 같습니다. 그리고 전체적으로 밴드가 끌리게 나오는 경우는 gDNA에서 실험해보면 은근 자주 보입니다.(사람 gDNA에서는요..) Genome이 크다보니 primer 서열에 따라 비슷비슷한 곳이 있어서 off-target의 증폭이 일어날 가능성도 꽤 되구요. primer를 바꿔보거나 PCR 조건을 조금 바꿔보면 끌리는 밴드가 줄어들 수 있습니다. 이러한 off-target 밴드들은 증폭 속도가 target 보다는 느리니까(linear vs exponential) 밴드가 target보다는 흐리게 나올거에요. 좀 더 깔끔한 밴드를 원하신다면 cycle 수를 조금 줄여보시거나, 시간을 바꿔보시거나 하면 될거같아요,
3. cDNA에서는 농도값과 발현량 사이에 상관관계가 존재합니다. 그러나, 아시다시피 PCR 과정에서는 bias가 생길 수 밖에 없기때문에 아주 정확하지는 않습니다만... 그러나 gDNA의 경우에는 밴드의 차이가 발현량과는 전혀 상관관계가 없습니다. 그리고 같은 종류의 세포라면 무조건 같은 양의 gDNA를 가지고 있습니다! (cell cycle 상 S기에 있는 경우는 제외... 분열을 위해서 DNA 양이 2 배 증가한 상태이니까요.) 샘플별로 차이가 나는 경우라면 gDNA 추출에 들어간 세포의 수, 추출 효율의 차이, 그리고 PCR 과정에서 증폭이 얼마나 잘 되었는가 등의 요인이 있을 수 있습니다.
좀 졸린상태라서 설명이 좀 두서없어보이는데, 도움이 되었으면 좋겠네요.