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 전체 > Immunology > ELISA
조회 9833  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 cytokine ELISA에 관한 질문입니다.
elisa  | 2007.09.13 15:13
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요. 요즘 ELISA 때문에 골머리 엄청 썩고 있는 한 연구원입니다. ㅠㅠ
Human plasma를 가지고 cytokine IL-1 beta, IL-6, TNF-alpha를 ELISA로 측정을 하고 있는데요. 현재 조건을 잡는 것은 plasma를 원액으로 사용할 것인지, 아니면 희석 배수는 얼마가 되는지 등등을 실험하고 있습니다.
serial dilution은 원액부터 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 정도로 잡아서 실험을 하고 있는데요. standard 값은 linear하게 나옵니다. 하지만 sheet에 있는 OD값과는 좀 다르더군요. 회사에 전화해서 여쭈어 보니 그 값은 이상적인 값이라고 하긴 하지만 값이 linearity하게 나오면 괜찮다고 하셨습니다만..
ELISA의 조건을 잡는다라고 하는것은 뒤에 이상적인 standard값이 나와야만이 조건이 잡힌것인가요?
그리고 serum을 사용해서 ELISA를 해 보신 분은 dilution factor는 얼마나 하시는지, 그리고 broad 하게 쓰이는 kit를 써도 무방한지 답변 좀 해주세요.
저는 원액에서도 거의 0값에 가까운 값이 나와서 어찌해야 할 지를 모르겠습니다.
저도 처음해 보는 실험이고 또 주변에 여쭈어 볼 만한 선배도 계시지가 않아서요..
부탁드립니다.
#ELISA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리LK Bio  |  2007.09.13   
standard값은 제일 높은 농도가 OD값이 2.0~2.5정도로 나오면서 curve가 linear하게 그려진다면 괜찮습니다. 그러면 실험 조건에는 문제가 없는 거지요.
담으로 plasma sample원액에서 값이 0이 나오면 그만큼 샘플에서 싸이토카인의 농도가 낮아서 그런거니까 싸이토카인을 농축을 해야하거나 또는 ELISA KIT중에서 high sensitivity kit가 있습니다.

yusik2@hotmail.com
올챙이궁금이  |  2007.09.14   
serial dilution 한다는 것은 무슨 말인지 모르겠구요,
저같은 경우 스탠다드는 구입한 거 프로토콜대로 해서 썼구요.
incubation time 이나 room temperature 차이에 의해서 스탠다드 커브는 조금씩 변합니다. 실험 여러번 해보면 큰 차이는 아니지만 조금씩 변하는거 볼 수 있을거에요.
그리고 stop solution 처리 후 시간에 따라서 조금씩 미세한 차이기는 하지만 수치가 변하는 것을 보실 수 있을거에요.
저도 R^2 값만 제대로 나온다면 큰 문제 없을 거 같은데요.
참고로 데이터 시트에 나오는 그래프는 예시일 뿐이라고 생각해요.
개구리ryan  |  2007.09.15   
standard의 OD값은 아무리 kit라 하더라도 달라질수 있습니다. 시험자, 시험 기구등에 영향을 많이 받죠. 윗분들이 말씀하신데로 standard curve가 Lineary를 가진다면 상관이 없을 듯합니다. 저의 경우 정량 실험시 4-PL과 log-log curve에서 R2값이 0.97이상인 구간을 standard 정량 구간으로 잡습니다.
보통 정량을 해본적 없는 sample을 시험할 때는 원액부터 dilution을 합니다. 가령 원액부터 10-fold serial dilution을 하여 대략의 dilution signal을 확인한 후, OD값의 변화가 있는 부분을 다음 시험시 start dilution point로 잡아 2-fold혹은 3-fold로 합니다. 단, standard의 dilution fold와 맞춰 주는 것이 실험하기 편하고, 또 정확하겠죠~^^

질문하신 분의 경우 원액에서도 거의 0비슷한 값이 나온다면, standard의 signal이 포화되지 않는 범위 내에서 시험 조건을 좀 바꿔 실험해 봐도 될 듯하네요. 가령incubation time을 늘린다면 signal의 증가를 볼 수 있다거나, 처리하는 antibody의 농도를 높여도 되겠지요. 단, 이미 제조되어 나오는 kit는 kit회사에서 적합한 조건을 기준으로 만든 것이기 때문에 그 쪽 분들에게 signal이 잘 나오지 않을 경우 조건을 바꾸어 실험해도 되는지, 그것에 대한 validation 자료는 있는지 등을 확인하신다면 님께서 조건을 바꾸어 시험한 결과에 대한 신뢰성을 가질 수 있으리라 봅니다.

elisa  |  2007.09.17    
답변 너무나도 감사드립니다. 다시 한번 더 해봐야겠습니다.
kamc77  |  2008.01.29    
저두 하고 있는데 plamsa 농도가 serum 보다 높게 나왔습니다..
특히 IL-6는 400ng/ml정도 나왔습니다..
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