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본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다. |
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cloning이란 참 쉬우면서도 어렵죠
써주신 대략의 protocol을 보면 틀린 부분은 없습니다. 하지만 이 과정만보곤 무엇이 잘 못 되었는지 알지 못합니다.
한가지 말씀을 드리자면 empty vector가 생긴다는 것은 insert를 빼고 vector 본인들 끼리 붙어서 그렇다는 것인데요
이때 phosphatase사용을 권해 드립니다. 이는 5'의 인산을 제거해서 서로 붙는 것을 방지할 수 잇습니다. |
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 미완의꿈 | 2014.08.13
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size가 거의 10kb 네요
transformation이 잘 안될 가능성이있습니다.
competent cell은 어떤걸 사용하시나요
이런경우 competent cell 효율이 매우 중요하게 작용합니다. |
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 Live Forever | 2014.08.13
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cloning님~
좋은 답변 감사드립니다.
일명 뻥벡터에서는 콜로니가 무수히 많이 뜬다고 말씀드렸는데 제가 말씀드린 뻥벡터는 아무 처리하지 않은 pBES2였습니다. 클로닝한 배지에는 아무런 콜로니도 뜨지 않으니 벡터끼리 붙은 것이 T.F됐는지는 아직 확인할 길이 없습니다. ㅠ_ㅠ 하지만 좋은 답변 감사드립니다! 한 번 시도해보도록 하겠습니다. ㅎㅎ
미완의 꿈님~
네, 저는 DH5알파를 가지고서 competent cell을 만드는데요
만드는 방법은 아래와 같습니다.
1. DH5알파를 16시간동안 3ml의 LB배지에서 진탕배양한다.
2. 50ml LB broth가 담긴 100ml 삼각플라스크에 배양액 0.5ml 접종 후 2시간동안 진탕배양한다.
3. 4도, 6000rpm에서 8분간 원심분리 후 상등액을 버린다.
4. 20ml의 차가운 50mM CaCl2를 넣어 pellet을 부유시킨 후 20분간 얼음에 박아둔다.
5. 4도, 6000rpm에서 8분간 원심분리 후 상등액을 버린다.
6. 2.5ml의 차가운 50mM CaCl2를 넣어 pellet을 부유시킨다.
이렇게 해서 만든 competent cell에 T.F 시키고 있습니다. ㅎㅎ
아, 근데 제가 지금 막 TA TOPO Cloning을 한 배지에서 콜로니가 떴습니다!
24시간 만에 떴어요.
제가 그동안 1X=100ul/ml 농도의 ampicillin을 넣은 LB agar 배지에다가 도말을 했었는데
실험실 언니가 이정도는 조금 높은 수준일 수 있다고 하시더군요.
T.F하는 동안 균이 열을 받는 등의 여러 작용으로 약해질 수 있으니 0.5X 농도로 항생제를 넣어보라고 조언해주셨어요.
그간 제 항생제 배지의 항생제 농도가 너무 높아서 이번에 24시간만에 콜로니가 떴고, 그동안 티끌같은 것은 보였지만 그것이 더이상 자라지 않았던 것일까요? 아직 김칫국 마시긴 이르지만 그래도 희망이 좀 보이네요.
선생님들은 어느정도의 농도로 항생제 배지를 만드시나요? |
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미완의꿈 | 2014.08.13
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역시 만들어서 쓰고 계셨군요...
그것도 O.D값도 측정하지 않으시고 --;
topo kit으로도 24hr만에 colony를 얻으셨다고하니
제가 보기엔 competent cell 효율이 문제였던것같네요
사서쓰는 competent cell도 필요한 경우가 있더라구요~
ampcillin은 저같은 경우 stock 농도 100mg/ml 로만들어
working 농도 100ug/ml로 쓰고있습니다.
cloning 할때도요.
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각 과정의 elution buffer를 H2O로 하셨는지요
cloning과정에선 kit의 EB buffer같은거 쓰지마시고 H2O로 하세요.
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안녕하세요
저의 짧은 견해로는 MunI 의 문제가 아닐까 싶습니다.
일반적으로 많이들 사용하는 제한 효소의 활성은 아주 신뢰가 가지만 때로 자주 쓰지 않는 제한 효소는 활성이 그리 우호적인지 못한 경우가 많습니다. 또한 님은 double cut 을 하신 것 같은데 이것 또한 각각 단계를 나눠서 해보심이 좋을 듯 합니다. MunI 을 먼저 하시고 gel extraction 을 해서 그 다음 XabI 으로 마무리 해보심은 어떨까요.
그리고 clony 가 나오지 않는 것은 cloing 이 안되서 그런것이니 걱정 않하셔도 될 것 같습니다. |
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competent cell을 만들어서 사용하시는 듯한데
competent cell의 효율성 문제일 가능성이 가장 크네요.
whole plasmid을 transformation 할 때는
competent cell의 효율이 10의 5승만 되더라도
lawn이 깔리게 됩니다.
그러나 일반적으로 ligation sample의 경우에는
ligation이 아주 잘 된 sample이라 하더라도
10의 6승 정도에서 colony가 겨우 몇 개 뜨고
저렇게 size가 큰 경우에는
최소한 10의 7승 이상
10의 8승 정도의 효율이 되어야
colony가 뜹니다.
그러니 competent cell을 새로 사시거나
electrophorator로 transformation을 시도해 보세요. |
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Live Forever | 2014.08.14
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미완의 꿈님, competent님
두 분의 조언이 많은 도움이 됐습니다. 그동안 뻥벡터에서는 콜로니가 무수히 많이 떠왔기 때문에 competent cell에 대해선 의심하지 못했습니다. 하지만 cloning한 벡터는 더 큰 효율의 컴셀이 필요하다는 말씀에 컴셀을 다시 만들어봐야겠다는 생각이 드네요. 그간 컴셀 만들 때 OD값을 재지 않았었는데(제가 본 protocol엔 OD값을 재거나 아니면 2시간 키우라고 나와있어서 OD값이 그렇게 중요한 줄 몰랐습니다. ㅠ) 앞으로는 OD값을 제대로 재도록 하고, 또 ultra competent cell을 한 번 만들어서 실험해보도록 하겠습니다.
음나님
네, 모든 과정에서 elution buffer 대신에 DW 사용하고 있습니다. 좋은 조언 감사합니다.^^
프라이님
일단 double digestion 한 후에 젤에 걸어보면 제가 생각했던 대로 잘려있긴 하거든요? 한때 제한효소를 의심해보기도 했었지만.. 그럼 우선 competent cell을 바꿔서 실험해본 후 그래도 나오지 않으면 님이 말씀해주신 방법으로도 실험해보겠습니다. ^^
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저두 지금 cloning을 몇달째 하고 있는데요
궁금한점이 있는데 순도를 높이는 과정에서 elution buffer를 쓰는대신 DW를 사용하셨다고 하는데.. DW를 사용해서 elution 하면 순도가 높아지나요?
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해조칼슘풍덩
차몬드
SPEED
가치있는같이
visavis
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