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질문 세균의 OD측정 후 colony counting -> 표준곡선
주리  | 2014.10.22 16:37
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: C.gracilis 표준곡선.xlsx (19 KB)

안녕하세요 도움을 얻고자 질문드립니다.
세균의 OD값을 측정하고 colony를 카운팅해서 표준곡선을 그리는 실험을 진행했는데요

우선 배양하던 균(C.gracilis) 10ml을 1ml의 PBS에 harvest했고 이걸 균 원액이라 했습니다.
원액을 1/10 씩 희석해서 4번까지 튜브에 만들었어요
그리고 각각의 튜브에서 200ul씩 따서 OD값을 측정했습니다.

0번 튜브 : 균 원액 -> OD : 1.758
1번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10) -> OD : 0.43
2번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10^2) -> OD : 0.053
3번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10^3) -> OD : 0.007
4번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10^4) -> OD : 0.004

그 다음에 각각 튜브에서 20ul씩 따서 PBS 80ul와 섞어서 희석 후
10ul씩 blood agar plate에 spreading했습니다.

배양 후 colony를 카운팅 했고 아래와 같이 결과가 나왔습니다.
0번 튜브 : 균 원액 -> OD : 1.758 -> 924 cfu
1번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10) -> OD : 0.43 ->240 cfu
2번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10^2) -> OD : 0.053 -> 29 cfu
3번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10^3) -> OD : 0.007 -> 7 cfu
4번 튜브 : 균 100ul + PBS 900ul (1/10^4) -> OD : 0.004 -> 2 cfu

이렇게 나왔는데 희석배수를 곱해주면
원액같은 경우에 4.6 x 10^5 cfu/ml 이렇게 나오더라구요
표준곡선 그린거 첨부 할께요 (왼쪽은 첫번째 실험 결과이고, 오른쪽은 다시 한 실험 결과에요)

문제는 실험에 사용하는 다른 세균들은 2 x 10^9 / 10ul로 양이 많은데
(다른 세균은 제가 colony counting한게 아니고 예전에 누군가 구해놓은 식이에요)
제가 이번에 카운팅한 세균은 이에 비해 매우 많이 부족하다는 거에요

실험 방법이 잘못 된건지.. 두번의 실험에서 비슷한 결과가 나와서 저 콜로니 갯수가 맞다고 한다면 바로 MOI에 적용할 수 있는건지 궁굼합니다.
(예를들어 2.4x10^5의 cell이 seeding 되어 잇고, MOI 1000으로 infection시
O.D값 x 4.6 x 10^5 : 1000(ul)=2.4 x 10^8xwell 수 : A(ul) 이렇게 식을 세우면 되는건가요?
세균의 크기가 문제가 되는 건가요? 다른 세균들보다 C.g가 2~3배 크기는 해요

조언 부탁 드립니다~~

#OD
 
#CFU
 
#표준곡선
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2014.10.22   
표준곡선 그린거 안올리셔서 잘은 모르겠지만......
원하는 정보는 "남이 했을때보다 내가한것은 OD 값에 비해서 cfu가 작다" 이건가요?
대장균도 균주에 따라서 OD 값과 cfu가 차이가 납니다.
서로 다른 종류의 세균이라면 차이가 크게나도 그리 이상한게 안될것 같습니다.
주리  |  2014.10.22    

파일 첨부를 깜빡해서 다시 했어요
cfu의 차이가 얼마 나지 않으면 괜찮은데
저 harvest해서 얻은 1ml에 세균이 460000개 밖에 들어있지 않는다는 건 너무 적은 것 아닌가요? ㅠㅠ

꽃개구리Kozmoj  |  2014.10.23   
1. OD vs CFU 는 세균의 종류에 따라 다를 수 있습니다.
예를 들어 크기가 큰 세포는 같은 cell 수에 OD 가 더 높게 나올 수 있습니다.

2. 첨부한 파일을 보니 희석 배수를 100 으로 잡았더군요.
원액 1 ml 에서 20 ul 를 취해서 100 ul 를 만들고 그 중 10 ul 를 취해서 spreading 을 했다면 
마지막의 10 ul 에 들어 있는 원액의 양은 2 ul 일 것입니다.
그렇다면 단위를 ml 로 만들기 위한 희석배수가 100 이 아니라 500이 되어야 합니다.

3. CFU vs OD standard curve 를 만들려면 균을 1/2 희석해야 합니다.
그래서 OD 범위가 0.1 에서 1.0 (개인적으로 0.6) 사이에 오는 점들을 취해 standard curve 를 만들어야 합니다.
왜냐하면 0.1 이하, 1.0 이상은 OD 측정의 유의 범위를 벗어나기 때문입니다.

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