안녕하세요.. bric에서 평소 많은 도움을 얻고있는 대학원생입니다^^
직접 질문 올리는건 처음인데.. 많은 조언 부탁드려요!!
저는 현재 cancer cell (glioblastoma cell)에서 특정 gene의 영향을 알아보는 실험을 진행중입니다.. 이 gene이 knockdown될 경우 cell의 morphology 및 invasion에 변화가 생기는 것을 확인하였구요, immunocytochemistry를 진행하여 cell의 actin 구조에도 변화가 생기는 것을 확인하였습니다. 이러한 actin의 변화가 microtubule의 변화에 의한 것이라 생각해서 immunocytochemistry로 microtubule 역시 staining하여 확인해보려 하고 있는데요..
alpha tubulin antibody를 이용하여 staining을 하였는데 (1:300)
아래 보시는 것처럼 잘 관찰이 되지 않습니다;;;
 
위의 이미지는 ZEISS LSM700 Confocal 현미경을 이용해서 water immersion, 400배로 촬영한 것입니다. 더 고배율인 렌즈, oil immersion으로도 촬영해봤는데 결과는 마찬가지라.. 장비의 문제는 아닌 것 같다고 생각하고 있습니다.
아무래도 실험 과정에 문제가 있는 것 같아 아래에 제가 실험 진행한 protocol을 정리해보았습니다.
(actin과 co-staining을 해야하기에 4% PFA로 fixation하였구요.. methanol로 하면 actin staining이 잘 안되더라구요..)
1) 1XPBS washing, 3times, RT
2) Fixation - 4% PFA, 5min, RT
3) 0.1% PBST(1XPBS + Triton X-100) sol. , washing, 3times, RT
4) Blocking (2% BSA + normal goat serum) 1hour
5) 1'Ab in antibody buffer(1X PBS 27ml + normal goat serum 250μl, BSA 30mg, 3% Triton-X 100(1XPBS에 희석) 3ml), 4℃, overnight
[Anti-alpha Tubulin antibody (abcam-ab18251) 1:300]
[Alexa Fluor® 488 phalloidin (invitrogen-A12379) 1:300]
6) 0.1% PBST(1XPBS + Triton X-100) sol. , washing, 3times, RT
7) 2' Ab in 2% BSA + normal goat serum, Alexa 594-rabbit, 1:300, 1hour, RT
8) 0.1% PBST(1XPBS + Triton X-100) sol. , washing, 3times, RT
9) DAPI staining in 0.1% PBST sol., 1:1000, 5min, RT
10) 0.1% PBST(1XPBS + Triton X-100) sol. , washing, 3times, RT
11) 3'DW, washing, RT
12) Mounting
어느 부분이 문제인걸까요...ㅠㅠ antibody 비율도 바꿔봤다가 fixation 시간도 조절해봤다가;; 제가 생각하기에 고칠만한 부분은 이것저것 해보긴 했는데 결과는 다 마찬가지네요..ㅠㅠ
경험 많으신 선배님들 조언 부탁드립니다.. |
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