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 전체 > Immunology > ELISA
조회 8941  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 ELISA standard curve Max OD가 반정도 밖에 안되요ㅠㅠ
ELISA  | 2015.01.30 16:26
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
한달 째 ELISA standard curve를 긋고 있는데 계속 OD값이 반정도밖에 안나오네요 ㅠㅠ
Ab의 활성이 떨어졌나 싶어서 선배님들이 실험을 해보셨는데 높게 나오고,
제가 했을 때 안나오는 걸로 봐선 제 실험 스킬에 문제가 있는 것 같은데
아무리 trouble shooting guide를 참고해서 여러 조건을 바꿔봐도 무엇이 문제인지 찾질 못해요
vortex 시간이 길어서 항체에 열을 주나 싶어 짧게도 해보고 well에 분주하는 속도때문인가 싶어서 빠르게도 해보고 느리게도 해보고, FBS점성과 버블때문에 정량이 안들어가는 문제인가 싶어 저울에도 달아봤어요 ㅠㅠㅠ... 

항상 Rsqr 값은 0.999가 나오는데 curve가 너무 flat해서 선배님들이 detection을 제조해봐 주시기도 하고 OPD를 제조해주시기도 하고 했는데도 변화가 없어요..

다른 여러 BRIC 질문을 참고해서 washing에 문제가 있나 싶었지만 그게 문제라고 하기엔
너무 튀는 값도 없이 깔끔하게 0.999가 나와서요ㅠㅠ
이제 더이상 뭐가 요인이 되는건지 무엇을 바꿔봐야하는건지도 감이 안잡히네요 ㅠㅠ
ELISA 도와주세요ㅠㅠ...

실험방법은 이렇게 해요

coating buffer 900μL에 capture Ab를 분주해서 8 well 2줄에 각각 50μL 씩 분주 후 
4도씨 overnight

0.05% PBST 200
μL로 3회 washing 후 10% FBS로 Blocking 상온 1시간

상온 1시간 반응 끝나기 30분전 standard stock 해둔것 10ng/mL 짜리를 녹여
1000pg/mL로 희석 후 단계별로 희석하여 냉장보관

Blocking 후 
0.05% PBST 200μL로 3회 washing 후 standard 50μL 분주하여 상온 2시간

반응끝나기 10분전 detection제조 (1mL 10% FBS 에 1
μL detection Ab, 4μL SAv-HRP)
반응 끝나면 
0.05% PBST 200μL로 5회 washing 후 detection 50μL씩 분주하여 상온 1시간

냉동시약 OPD를 반응 끝나기 30분전 칭량한 후 citrate buffer와 H2O2를 분주하여 녹이고
반응 끝나면 
0.05% PBST 200μL로 7회 washing 후 30초 soak time 거치고 OPD 50μL씩 분주하여 상온 암반응 30분

stop solution으로 2N 황산 50
μL 사용, 490nm 흡광도 측정


실험방법은 이렇구요 ELISA kit는 BD biosciences 꺼 사용합니당 ㅠㅠ

한달째 이것만 잡고 있는데 너무 안풀려서 속상한마음만 가득하네요 ㅠㅠ
도와주세요 선배님들ㅠㅠ


#ELISA
 
#standard curve
 
#flat
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리szzang  |  2015.01.30   

특별히 과정상에 문제는 없어 보이네요...
다만, step 뒷부분에 washing 이 많네요... 꼭 이렇게 많이 하는 이유라도 있는지 보통 washing은 3~4회 정도만 해줘도 충분한 걸로 알고 있는데...

실험상 가장 걱정되는 부분은 반응을 다 상온에서 하신겁니다. 혹시 언제부터 반으로 줄었는지 모르지만 반응은 일정한 온도에서 하시는 것이 좋을 겁니다. 특히 항체 붙이는 반응은 온도 영향을 생각보다 많이 받거든요... 온도 차에 의해서 그런 현상이 발행했을 가능성이 높아 보입니다.  겨울이잖아요...

가능함 일정한 온도를 유지하는 인큐베이터에서 하시는 것이 바람직 할겁니다. RT에서 되는 실험도 많지만 elisa 실험에서 재현성을 위해서라도 온도는 일정하게 해주시는 것이 좋을 걸로 보이내요...

온도 이외에 특별히 문제될 부분은 없어보입니다.

꼭 좋은 결과 얻으세요~

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