실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
고수님들 도움요청//단백질 분리문제 중 문제발생.
protein (비회원)
안녕하세요, 저는 E.coli를 이용.target gene을 overexpression시키고있습니다. 6 개월정도 벡터와 호스트를 변경해가면서 insoluble로 발현되는걸 chaperone plasmid와의 coexpression을 통해서 soluble fraction으로 발현하는데 성공하였습니다. 그런데 이런, (vector가 pCold I인데요, 이벡터는 His tag을 가지고 있습니다) 단백질이 니켈 컬럼에 바인딩이 전혀 안됩니다.ㅜㅜ 어제까지만 해도 멀쩡히 사용하던 컬럼인데 말입니다. 그래서 내린 결론은 단백질의 구조상 his taq이 말려들어가서 그런걸 것이다 라고 생각했습니다. 다음스텝을 어떻게 진행해야 할 지 몰라, 그냥 흔히 쓰는 Hiprep Q 컬럼을 이용해서 A>>25 mM Tris-Hcl (pH7.5) B>>A+1 M NaCl target 을 100%로 하여 컬럼을 걸었는데, 또 이런, 또 바인딩을 안한 겁니다ㅜㅜ 일루션 결과 두개의 픽이 나왔는데 두개의 픽 다 sds-page결과 샤페론(60,56 kDa)이더라구요 저의 사랑스런 프로테인은 *.-;; 모두 언바운드로 빠졌더군요,, 그렇다고 언바운드에 제 프로테인만 있는 것도 아니고 제 프로테인과 샤페론프로테인이 동시에 있더라구요 언바운드에, 그래서 또 다시 원점입니다.ㅜㅜ 도대체가 머리가 멍해져서 다음 스텝을 진행을 할 수가 없습니다.ㅜㅜ 방금 gel 사진을 보고 정말 분통이 터져서 ^^; 흥분을 가라앉히지 못하고 주저리주저리 이렇게 글 올립니다. 고수님들 좀 도와 주십시오.. 다음 스텝을 어떤 것을 해야할까요? 아차 제 프로테인 사이즈는 66정도 로 예상됩니다. 샤페론과 사이즈가 다 고만고만해서 gel filtration을 한다고 해도 분리가 잘 되지 않을 것 같기도 한데,, 제발제발 도와 주십시오.. 제 질문 중 뭐 빠진 것이라도 있으면 댓글 달아주시구요..
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