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cloning이 잘 안됩니다 |
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cloning 무지 | 2015.06.18 19:39
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답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의) |
안녕하세요
저는 현재 cloning에서 몇 개월째 헤매고 있는 사람입니다.
저는 지금 pETDuet-1에 약 1.5kb gene이 들어가 있는 plasmid에 약 2kb가량의 gene을
cloning하려고 합니다.
저의 cloning은 이렇습니다.
- primer 설계시 제한효소 앞 염기 4개를 추가하여 제한효소처리의 효율 증가
- Taq polymerase 사용 (promega)
- 제한효소 처리 (insert는 20h, plasmid는 1h → insert는 제한효소가 20h 이상처리할때 90%의 효율이 나오기 때문에 이렇게 하고 plasmid는 1h 이상 처리하면 밴드가 나오지 않더라구요)
- 제한효소처리 후 DNA purification으로 gel loading 후 DNA conc. 재기
- 약 1:3의 비율로(insert 3) ligation (pormega) room temp. O/N
- DH5alpha com.cell (hit com cell)로 transformation
이렇게 했는데 콜로니가 전혀 뜨지 않습니다
항생제는 amp.을 사용하고 있고 플레이트에 항생제 농도를 낮추어 spreading을 해보았지만 뜨지 않습니다.
각 단계를 확인하기위해 4가지의 조건으로 또 나누어 실험을 해보았는데
- 원래의 plasmid transformation
- 원래의 plasmid HindⅢ로만 제한효소처리 후 transformation
- 원래의 plasmid NcoⅠ으로만 제한효소처리 후 transformation
- 원래의 plasmid HindⅢ, NcoⅠ로 처리, insert도 동일하게 처리후 ligation까지 하고 transformation
이렇게 한 결과 제일 처음의 경우에서만 colony가 생성되었습니다 그것도 아주 많이요..
어찌해야 할까요 저는...ㅠㅠ |
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#cloning #R.E.T #10KB |
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