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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR band가 갑자기 안나와요.
멘붕  | 2015.11.25 15:53
 답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: IMG_7160.JPG (1.08 MB)
이미지 첨부파일
pcr을 하는데 band가 잘 나오다가 어느순간 갑자기 band가 안나와서
primer도 다시 주문해보고, 기계도 다른 pcr 기계 써보고, 다른사람이 해보고
DW도 바꿔보고 했는데도 똑같이 band가 안나와서요ㅠㅠㅠㅠ
원래부터 안나오던거면 annealing 온도나, primer 문제가 있다고 생각할텐데
band가 갑자기 나오다가 안나오는거라서 어떻게 해야할지 모르겠네요.
다른사람들이 다른 gene의 primer로 했을때는 다 나와서 premix나 DNA 오염도 아닌것 같고
그래서 멘붕이 되었습니다. 

annealing온도가 잘못됐을까봐 gradient 돌려서 확인했는데도 gradient 조차 band가 하나도 안나오네요.

pre-mix를 사용중이고요.
pre-mix에 primer forward&reverse 1ul씩, DNA 1ul, DW 17ul 넣어서 
조건은 95℃ 5분, (95℃ 30초, anneeling- 55℃ 30초, 72℃ 30초)X35cycle, 72℃ 5분한 후
2%gel, 0.5x TBE buffer에서 gel loading 했습니다.

도와주세요ㅠㅠ
#pcr
 
#no band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2015.11.25   

전과 이상이 없는 실험이다.
나오던데 안나온다.
할수 있는건 다 했는데 이유를 모르겠다.
그럼 마지막 남은건 template DNA 문제 인듯 합니다. cDNA라면 다시 합성을 해보시는것은 어떨까요?
개구리Marine  |  2015.11.26   
사진에서 marker제외한 well이 전부다 smear가 보이는데
DNA양이 너무 많아서 그런건 아닐까 생각되네요
cDNA 인지 gDNA인지 모르겠지만 gDNA라면 농도를 1/10, 1/100 정도로 희석해서 해보시는게 좋을 것 같습니다.

template가 너무 많아도 PCR 안됩니다.
올챙이행전남  |  2015.11.26   
다른 분들이 다른 gene의 primer로 했을때는 다 나왔다는 의미는 PCR과정에는 문제가 없다는 걸로 차이점인 primer의 문제이거나 가장 본질적으로 타겟으로 하는 유전자의 발현이 거의 없는 건 아닐지 생각이 됩니다. ^^
멘붕  |  2015.11.27    
gDNA로 했구요!DNA 문제라면 다른 gene의 primer로 했을때도 안나와야하는데 잘 나오는거보면 DNA의 이상은 없는것 같고요. 그리고 primer 문제면 전에는 band가 잘 나왔어서요.
그래서 도저히 모르겠어서 DNA양도 달리해보고 extension 시간도 늘려보고 cycle도 30으로 해보고 했는데도 똑같이 저렇게 나오더라고요.ㅠㅠ
개구리캐틀  |  2015.11.30   

혹시 gel 제조 하실때 dye로 EtBr 사용하시나요???
올려주신 사진이 예전에 제가 겪얶던 거랑 비슷한 양상을 보이느것 같아서요...

저의 경우에는 gel이 문제 였었거든요...
EtBr을 gel 녹이고 굳히기 전에 넣어주고 흔들어 mix하고 gel tray에 부어 굳히는데..

gel에 EtBr이 충분히 mix 되지 않았을때 저렁 현상이 나타났던것 같아서요.....

pre-Stainning 방식이 아니라 post-staning이나 직접 sample과 staining dye를 mix해서 분주 하신다면 이야기는 달라지겠지만요...
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