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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
조회 3650  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 caspase-3
caspase-3  | 2006.04.19 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
저번에. cleaved caspase-3 (cell signaling 제품이에요) 에 대해 물어봤었는데요..
어떤 분이. 친절히 가르쳐 주신대로.. 실험을 다시 했는데..
필름에.. 잡밴드 하나.. 없이. 그냥.. ㅠ.ㅠ

제가 한.. 방법은. 아무것도. treatment를 하지 않은 lysis 한 셀을 가지고
단백질량을 50,60,70 80 100 으로 하였습니다 그리고 희석 배수는 프라이머리는 1:1000(4도시에서 오버나잇) 2ndary는 1:5000(실온에서 1h) 발색시약은 pierce 제품으로 하였습니다.
그래도 이 밴드 안 나옵니다. 제발. 고수님들의 방법 좀. 자세히 알려주세요..
비율과 시간.. 등등이요.~~
#caspase-3
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
bio  |  2006.04.19    
지난번 그 bio입니다..학교에선 한글을 사용할수없어서..

혹시 cell signaling에서 온 secondary antibody (rabbit 맞죠?)를 사용하셨나요?
같이 딸려 들어오는 cell signal secondary는 stability가 좋지 않아서
이게 맛이 가면 signal을 detection할수가 없읍니다..
저도 한번 삽질한 적이 있죠..
덕분에 회사 tech와 전화로 싸워서 새 안티바디를 통째로 얻어내기는 했지만..
한국에서도 구매업체에 한번 문의해서 새거 얻으실수 있는지 알아보시구요..^^
(혹시 실험이 된다면..^^)
전 secondary는 그냥 다른 제품것을 사용하거든요..
혹시 랩에 다른 secondary rabbit이 있거나 옆 랩에서 빌리실수 있으시다면
그것으로 한번 다시 해보세요..
caspase-3 경우에는 normal상태에서도 full length는 잡힐테니깐..
저도 primary는 1:1000 (4도 overnight)secondary는 1:3000-5000 (상온 2시간)으로 사용합니다.
loading은 50 100 200정도면 될거 같은데요...
단백질 너무 많이 loading하면 gel내리는데 문제생기니깐..
그럼 다음에 빵빵한 밴드 확인하실수있기 바랍니다..^^
^^  |  2006.04.19    
cleaved caspase 3를 detection 하고 싶으시다면

apoptosis를 induction 해야하지 않을까요?

Ab가 caspase-3와 cleaved caspase-3를 모두 잡는 것이라면
아무 처리하지 않은 cell에서 caspase-3는 물론 나와야 하지만요..

그리고..제 경험으로는 caspase detection을 위해서 protein을 200-300 ug 사용했던 것 같습니다..

50,60,70,80..이렇게는 별 의미가 없는 것 같고
담번에 할때는 50, 100, 200, 300 이렇게 올려가면서 해 보세요..

특히 apoptosis를 유도해서 control과 비교하는 경우라면
apoptosis를 유도하는 그룹은 cell 은 더 많이 setting해서 prep하는 것이 좋겠습니다

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