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 전체 > Chemical biology > Extraction/Concentration
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질문 Ni-NTA agarose에 binding 시킨 단백질을 끓여서 떼어낼 수 있나요?
개구리박재용  | 2008.03.11 07:57
His-tag이 달린 protein을 Ni-NTA agarose에 binding 시킨 다음에 SDS-sample buffer를 넣고 끊이면 단백질이 떨어져 나오는지 궁금합니다...

아니면 Imidazol elution을 해야만 합니까?

정제된 단백질을 Ni-NTA agarose에 binding 시킨 다음 cell lysate를 가지고 binding 하는 단백질을 찾으려고 하고 있습니다. 물론 많은 background로 인해 쉽지 않을 것 같습니다만 한번 해 볼려고요..
끓여서 바로 SDS-PAGE 걸수 있다면 매우 편리할 것 같습니다. imidazol elution을 해야 한다면 양이 적어서 농축을 해야 찾으려는 단백질이 확인 될 것 같거든요..

아시는 분 있으시면 알려주세요..
#Ni-NTA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리아라곤  |  2008.03.11   
SDS buffer로 당연히 떨어집니다.

하지만 해보시면 그냥 bead에 붙는 단백질이 생각보다 훠얼씬 많다는걸 아시게 될 겁니다.. -_-
Mad Scientist  |  2008.03.11    
버퍼 넣고 끓이면 붙은 단백질은 모두 다 나올 것입니다.

그러나 Ni-NTA는 Nonspecific binding 이 꽤 많은 affinity resin 인 관계로 반드시 negative control (단백질 안 붙인것) 을 하시는 것이 좋겠고 (아마 그냥 Cell Lysate 를 걸고 Washing을 많이 해도 상당히 많은 단백질이 붙어나올 것입니다), Protein 은 가능한 적은 volume의 bead 에 saturation 되게 붙이는 것이 좋을 듯 합니다.
대왕개구리엘피스  |  2008.03.11   
6xHis-Ni-NTA 결합은 이온결합이기 때문에 끓이면 당연히 protein이 떨어져 나올겁니다. 하지만 많은 non-specific이 존재하기 때문에, full down assay등에는 잘 이용하지 않는 것이 his 방법입니다.

이런 경우, 차라리 GST fusion protein을 사용하시는 것이 좋지 않을까 하면,
또한 Ni-NTA resin에서 단백질을 모두 떼는 방법은 끓이는 것보다는 EDTA로 Ni ion까지 모두 떨구는 방법이 좋을 듯합니다.
e^^  |  2008.03.11    
저는 그거 제품으로 나온거 썼던거 같은데요.. 오래돼서 기억은 가물가물 한데
키트로 나온 컬럼 써서 정제 후, 웨스턴 했었어요.
개구리박재용  |  2008.03.12   
답변 감사합니다.

그냥 Ab 써서 pull down 해야겠네요..

magnetic Ni-NTA bead로 pull down 하는 방법이 있길래 한번 해 볼까 했더니 (SDS-PAGE 상에 Ab band가 없어질테니 유리하겠다고 생각하고) nonspecific binding이 많다면 의미가 없는 것이겠지요..
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