저는 zebrafish embryo에 시료를 처리하여 western blot을 통해 iNOS와 COX-2를 보고자 하였는데 band가 나오지 않아 막막합니다.. 여기저기 찾아보았는데 잘 모르겠네요ㅜㅜ
저희는 bio rad의 gel을 사서 쓰는데 처음에는 유통기한이 지난 것으로 해서 gel 상태가 좋지 않아 안나오는 것 같아 gel을 새로 사서 다시 돌려보았는데도 똑같이 뜨지 않네요...ㅠㅠㅠ
단백질 정량 결과 단백질이 있는 것으로 나왔구요.. cell로 진행하였을 때는 잘 나왔는데 zebrafish로 진행하니 나오지 않습니다ㅠ
실험과정에서 잘못된 부분을 지적해주시면 감사하겠습니다..ㅜ

(1) 단백질 수거
   1. zebrafish embryo를 well당 50개에 시료를 처리하고 3일 후 PBS로 wash를 수행하고
      물기제거
   2. RIPA buffer 120ul를 넣어주고 homogenizer로 파쇄 (ice 상에서 진행)
   3. sonication (넣었다가 빼서 ice에 넣고 2-3번 반복)
   4. vortexing 10분간격으로 5-6번
   5. 13300rpm, 25min, 0도 원심분리하여 상층액 수거
   6. bio rad protein assay로 정량

(2) SDS-PAGE (시약과 기계 전부 bio rad 것 이용)
   1. 단백질과 sample buffer를 넣고 100도에서 10분간 boiling
   2. 1X running buffer 제조하여 gel 사이에 부어주고 나머지는 탱크에 부어주기
   3. 10분 지난 후 ice
   4. well에 15ul씩 loading
   5. 80V, 75mA, 2시간 20분 전기영동
 
(3) Tranfer (시약과 기계 전부 bio rad 것 이용)
   1. gel을 membrane위에 기포가 없게 올려주고 위에 top이라고 적힌 것 올려주기
      (Trans-Blot® Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs #1704158 이것을 이용합니다.
          : 한 세트씩 포장되어 있음)
   2. 7분간 run (제품 protocol에 명시되어 있음)
   3. membrane을 잘라 TTBS 로 5분간 wash 후 5% skim milk로 blocking (o/n)

(4) Antibody ~ 현상 (antibody : cell signaling 이용)
   1. TTBS 10분 - DW 5분 - TTBS 5분 wash
   2. 1st antibody - 1:1000으로 5% skim milk로 희석하여 o/n
     (이전에는 4시간 정도 붙였으나 나오지 않아 이번에 o/n하였습니다..)
   3. TTBS 10분 - DW 5분 - TTBS 10분 - DW 5분 - TTBS 10분
   4. 2nd antibody - 1:30005% skim milk로 희석하여 o/n
   5. TTBS 5분씩 3번 wash
   6. ECL solution 처리 후 Chemidoc을 이용하여 현상


전기영동시 반 이상 내려오면 gel 사이에 있던 buffer들이 새면서 내려오는 속도가 느려졌는데 이것도 혹시 영향을 미칠까요..? gel을 조립하고 buffer를 부은 후 새지 않는 것을 확인하였는데 전기영동을 돌리면 이렇게 되버려서..ㅠㅠ 많은 조언 부탁드립니다.